Rhesus faktor, Rh faktor, Rh skupina, antigen D

Kromě klasického D antigenu rozlišujeme:

antigen D^w (weak) – kvantitativně slabší D antigen (redukovaný počet antigenů na erytrocytech), nositel tohoto antigenu se může označit jako RhD+,

antigen D^var(variant) – kvalitativně změněný antigen D, u kterého chybí jeden nebo více epitopů, nositel tohoto antigenu je v případě dárce považován za RhD+, v případě příjemce RhD negativní.

D^U – v minulosti se používalo pro D^w a D^var.

K vyšetření se používá jak srážlivá, tak nesrážlivá krev. Jako antikoagulační činidlo jsou nejvhodnější draselné soli kyseliny etylendiamintetraoctové (EDTA). U nesrážlivé krve je nutné vyvarovat se odběrovým zkumavkám se separačním gelem. Vzorek se centrifuguje 10 min při 1800 až 2500 g, nejlépe dle doporučení výrobce odběrového systému.

Materiál je stabilní 12 h při 18 – 25 °C, 7 d při 2 – 8°C. Oddělenou plazmu nebo sérum je možné skladovat 6 měsíců při teplotě ≤ -20°C. 

Jedná se o imunoaglutinační metodu založenou na reakci antigen-protilátka. K vyšetření se v současnosti používají komerčně vyráběná séra, která obsahují monoklonální protilátky. Nutné je použití dvou různých antisér, a to takových, aby každé reagovalo s jiným epitopem antigenu D. Druh protilátek si volí každá laboratoř sama, tak aby nezachycovala nejčastější variantní antigeny D (např. D^IV-klinicky nejvýznamnější variantní antigen). Nejčastěji se používají monoklonální protilátky třídy IgM, jelikož k aglutinaci dochází v solném prostředí (fyziologický roztok). Je možné použít i jak monoklonální, tak i polyklonální protilátky třídy IgG, ale ty musí být použity v bílkovinném prostředí (nejčastěji hovězí albumin), nebo v nepřímém antiglobulinovém testu. V případě příjemců transfuzních přípravků, obsahujících erytrocyty, postačuje vyšetření s dvěma IgM protilátkami. Při vyšetření dárců krve nebo novorozenců je nutné v případě negativní reakce pokračovat vyšetřením v nepřímém antiglobulinovém testu s protilátkou třídy IgG. V praxi se to provádí tak, že laboratoř si zvolí dvě reagencie, z kterých každá obsahuje protilátku třídy IgM (se specificitou k jinému epitopu) a jedna z těchto reagencií navíc obsahuje i protilátku třídy IgG. V první fázi se provede reakce paralelně ve dvou zkumavkách a v případě negativních reakcí, nebo diskrepantního výsledku (jedna reakce pozitivní, druhá negativní) se u příjemce vyhodnotí RhD jako negativní. V případě dárce nebo novorozence se mohou obě zkumavky nechat inkubovat 5 – 10 min při 37 °C pro zesílení reakce. V případě negativní reakce i v tomto kroku, se dále pokračuje se zkumavkou, která obsahuje protilátku třídy IgG. Obsah zkumavky se minimálně 3x propere v nadbytku fyziologického roztoku a po poslední dekantaci se k sedimentu přidá protilátka proti lidským imunoglobulinům (AGH – anti human globulin). Princip stanovení vychází z toho, že v prvním kroku dojde k navázání IgG protilátky na erytrocyty, ale ta není schopná vyvolat aglutinaci v solném prostředí, proto se aglutinace podpoří přidáním další protilátky (AGH), která je schopná vázat IgG na erytrocytech (přemostit) a způsobit aglutinaci. AGH je citlivá na přítomnost jakýchkoli lidských globulinů, promytí erytrocytů je nutné, aby se odstranilo i stopové množství séra, resp. plazmy. V případě pozitivní reakce je RhD u dárce uzavřen jako pozitivní. V případě negativní reakce je nutné provést kontrolu promytí kontrolními senzibilizovanými krvinkami. Jsou to komerční krvinky, které mají na svém povrchu navázané protilátky třídy IgG. V případě správného postupu senzibilizované krvinky reagují s AGH a objeví se aglutinace. (V případě negativní reakce je nutné celý postup opakovat s důrazem na odstranění stop lidských globulinů.) Při provádění vyšetření je nutné použit negativní kontrolu, která slouží pro zachycení falešně pozitivních reakcí. Toto kontrolní sérum má stejné složení jako diagnostické sérum obsahující IgM+IgG, ale neobsahuje žádnou protilátku. Výsledek s kontrolním sérem musí být negativní. V případě pozitivity v AGH fázi vyšetření je vyšetření variantního D antigenu neplatné, jelikož mohou být erytrocyty už senzibilizované (pozitivní přímý antiglobulinový test).

Samotné provedení testů, může být plně manuální, poloautomatické, nebo plně automatizované. Vyšetření můžou být prováděná na podložním skle (pouze orientační vyšetření), na mikrotitračních destičkách, ve zkumavkách, nebo metodou sloupcové aglutinace. Výhodou vyšetření na mikrotitračních destičkách je možnost zpracování většího počtu vzorků. Komerčně jsou dodávané mikrotitrační destičky s už předběžně připravenými séry. Metoda může být i plně automatizovaná. Odečet reakcí může být vizuální nebo spektrofotometricky. U vyšetření sloupcovou aglutinací se využívá speciální mikrozkumavka s vrstvou dextran-akrylamidového gelu nebo skleněných mikročástic, kterou musí erytrocyty překonat při centrifugaci. Vrstvou projdou jenom neaglutinované erytrocyty. U tohoto vyšetření může být protilátka už obsažená v mikrozkumavce. Metoda sloupcové aglutinace může být také plně automatizovaná; odečet reakce je na základě analýzy obrazu. Při vyšetření používáme 0,8 – 5 % (dle způsobu provedení) suspenzi erytrocytů aspoň 1x propranou ve fyziologickém roztoku. Výjimkou je pupečníková krev novorozence, kterou je nutné promýt aspoň 3x. Při orientačním vyšetření na podložním sklíčku je možné použit přímo plné krve bez centrifugace. Kapku krve a diagnostického séra přeneseme na podložní sklíčko, důkladně promícháme a krouživým pohybem podložního sklíčka podporujeme aglutinaci. Aglutinace svědčí pro přítomnost daného antigenu. V případě vyšetření na mikrotitrační desce je aglutinace podporována centrifugací a třepáním na třepačce, nebo použitím samotné třepačky. U zkumavkového vyšetření se aglutinace podporuje rovněž centrifugací. Při hodnocení se semikvantitativně posuzuje síla reakce: 0 resp. negativní a pozitivní 1+ až 4+.

přítomnost chladových protilátek, přítomnost nespecifických protilátek na kteroukoli složku diagnostických roztoků, senzibilizace erytrocytů (pozitivita v přímém antiglobulinovém testu), hemolýza.