norepinefrin, noradrenaline, norepinephrine; Arterenol

4,5-β-trihydroxyfenethylamin, 4-[(1R)-2-amino-1-hydroxyethyl]-1,2-benzendiol

Stanovení se provádí v séru nebo moči. Krev je stabilní při 25 °C 2 h (s heparinem nebo glutationem), při 4 °C 2 h. Sérum při 4 °C 2 h, při -20 °C několik týdnů. Plazma s heparinem nebo EDTA při 25 i 4 °C 24 – 48 h. Diurnální variabilita s maximem 9 – 12 h, minimem 2 – 5 h. Před odběrem dieta (vyloučit sýry, banány, kávu, kakao, aromatické moučníky, alkohol, ovoce, zeleninu, ořechy, nekouřit), 4 h nejíst a nepít, 30 min. ležet se zavedeným žilním katétrem. Krev transportovat v chladu. Moč uchováváme při laboratorní teplotě (před odběrem dodat HCl nebo CH₃COOH) 2 dny – 2 měsíce, po okyselení na pH 1,4 při -25 °C dlouhodobě. Diurnální variace v moči minimum 2 – 5 h, maximum 9 – 12 h.

Fluorimetrie je citlivější než fotometrie. Je založena na chemické oxidaci a tautomerizaci adrenalinu a noradrenalinu na jejich trihydroxyindolové deriváty. Před oxidací se moč hydrolyzuje a částečně purifikuje katexovou chromatografií (pH 6,5). Adrenalin a noradrenalin se nedělí a stanovuje se společně po eluci kyselinou boritou. Provede se oxidace ferrikyanidem draselným v přítomnosti zinečnatých iontů. Po alkalizaci se produkt reakce odbarví a přebytek ferrikyanidu se rozloží kyselinou askorbovou. Pro fluorescenci je excitace 405 nm, emise 495 nm. Při metodě ruší fluoreskující léky jako α-metyldopa, izoproterenol, labetalol nebo tricyklické antidepresanty.

RIA Do jamek s boronátovým afinitním gelem se pipetují standardy, vzorky a extrakční pufr (inkubace 30 min, třepání, laboratorní teplota). Po inkubaci se kapalina vylije a destička vyklepne na papírový ručník, přidá se destilovaná voda, destička se třepe 5 min za laboratorní teploty, vypláchne a opět vyklepne na papírový ručník. Přidá se 0,05 M HCl a provede se kyselá hydrolýza 15 min (třepání, laboratorní teplota). Poté se pipetuje do acylačních zkumavek kyselý extrakt, katechol-O-metyltransferáza s koenzymem S-adenosyl-L-metioninem a inkubuje 60 min při 37 °C. Pak se přidá adrenalin značený ¹²⁵I nebo noradrenalin značený ¹²⁵I a králičí antisérum vůči adrenalinu nebo králičí antisérum vůči noradrenalinu s následnou inkubací 15 – 20 h při 2 – 8 °C. Po imunoreakci se imunokomplex vysráží druhou protilátkou (kozí proti králičímu IgG) v polyetylenglykolu (15 min, laboratorní teplota), odstředí a po dekantaci se měří radioaktivita sraženiny 1 min gama-počítačem. Signál na základě šestibodové kalibrace je nepřímo úměrný koncentraci. Rozsah metody sérum 0,02 – 10 µg/l noradrenalinu, moč (ředěná 16x) 0,8 – 400 µg/l noradrenalinu. Analytická citlivost 0,02 µg/l noradrenalinu, funkční citlivost 0,05 µg/l. Preciznost v sérii: plazma 7,9 – 10,4 %, moč 3,2 – 8,5 %; mezi sériemi: plazma 14,9 – 18,5 %, moč 11,0 – 15,8; zpětný výtěžek: plazma 82 – 101 %, moč 92 – 102 %; linearita ředění: plazma 92 – 113 %, moč 76 – 112 %. Interference < 15 % je při 4 g/l hemoglobinu, 684 µmol/l bilirubinu a 25,7 mmol/l triacylglycerolů. Křížová reaktivita normetanefrinu je 0,5 %, ostatní < 0,1 %.

ELISA Do jamek s boronátovým afinitním gelem se pipetují standardy, vzorky a extrakční pufr (inkubace 30 min, třepání, laboratorní teplota). Po inkubaci se kapalina vylije a destička vyklepne na papírový ručník, přidá se destilovaná voda, destička se třepe 5 min za laboratorní teploty, vypláchne a opět vyklepne na papírový ručník. Ještě jednou se přidá destilovaná voda, destička se třepe 5 min za laboratorní teploty, vypláchne a opět vyklepne na papírový ručník. Přidá acylační činidlo s pufrem a nechá se působit 15 min za laboratorní teploty. Destička se vylije a vyklepne na papírový ručník, přidá se destilovaná voda, destička se třepe 10 min za laboratorní teploty, vypláchne a opět vyklepne na papírový ručník. Následuje kyselá hydrolýza s 0,025 M HCl 10 min za laboratorní teploty (třepání). Takto upravený a naředěný vzorek se pipetuje do jamky mikrotitrační destičky potažené noradrenalinem. Následně se přidá katechol-O-metyltransferáza s koenzymem S-adenosyl-L-metioninem a inkubuje se 30 min (třepání) za laboratorní teploty. Pak se přidá králičí antisérum vůči noradrenalinu a inkubuje se 120 min za laboratorní teploty (třepání). Po trojnásobném promytí se přidá protilátka vůči králičímu IgG s peroxidázou a inkubuje se 30 min (třepání) za laboratorní teploty. Po trojnásobném promytí se přidá tetrametylbenzidin a inkubuje se 25 min (třepání) za laboratorní teploty ve tmě. Po přidání stop činidla (0,25 M H₂SO₄) se absorbance odečítá do 10 min při 450/620-650 nm. Naměřený signál je nepřímo úměrný koncentraci noradrenalinu. Rozsah šestibodové kalibrace 0,05 – 1000 µg/l. Mez detekce plazma 0,05 µg/l, moč 1,5 µg/l. Křížová reakce: normetanefrin 0,48 %, adrenalin 0,14 %, ostatní < 0,1 %. Preciznost v sérii 9,8 – 16,1 %, mezi sériemi 8,5 – 15,0 %. Linearita ředění 84 – 123 %, zpětný výtěžek 83 – 115 %.

GC-MS směs katecholaminů byla vysušena v proudu dusíku a silylována v přítomnosti etylacetátu buď N-metyl-N-(trimetylsilyl)-trifluoracetamidem (MSTFA) nebo N-metyl-bis(heptafluorbutyramidem) (MBHFBA), což se jeví jako nejlepší způsob. Rozsah metody je pro trimetylsilylované deriváty je 20 – 5000 µg/l pro adrenalin a noradrenalin, resp. 5 – 500 µg/l pro dopamin. Chromatografie (kapilára 25 m x 0,2 mm) byla při teplotách 120 – 280 °C. Hmotnostní spektrometr používal režim selektivního monitorování iontů, jako vnitřní standardy byly použity odpovídající izotopy. Takto byl stanoven adrenalin, noradrenalin i dopamin.

HPLC v izokratickém režimu s elektrochemickou detekcí (potenciál 500 mV) je určena ke stanovení adrenalinu, noradrenalinu i dopaminu. Uvedené katecholaminy se vážou na oxid hlinitý v TRIS pufru (třepání 10 min). Po centrifugaci se supernatant dekantuje, přidá se voda, suspenze se protřepe, centrifuguje a supernatant se dekantuje. Postup promytí se ještě jednou opakuje. Pak se uvolní katecholaminy kyselou hydrolýzou (HClO₄). Reakce probíhá 5 min (třepání). Následuje centrifugace a supernatant se opatrně odsaje a může se skladovat 24 h při 4 °C. Chromatografie probíhá na katexu se silikagelem 150 x 4,6 mm. Jako vnitřní standard slouží 3,4-dihydroxybenzylamin. Mobilní fáze je acetonitril s citrátovým a fosfátovým pufrem (pH 6,5). Měřící rozsah 15 – 2000 µg/l pro adrenalin, noradrenalin i dopamin.

LC-MS/MS předchází extrakce do pevné fáze, kterou lze provádět současně u všech šesti analytů. Kapalinová chromatografie trvá 4 min a umožňuje stanovit adrenalin, noradrenalin, dopamin, metanefrin, normetanefrin a 3-methoxytyramin. Jako vnitřní standardy se používají dopamin-D4, noradrenalin-D6, adrenalin-D6, 3-methoxytyramin-D4, normetanefrin-D3, metanefrin-D3 (rozpuštěné v matrici čisté moče). Po kyselé hydrolýze vznikají při extrakci difenylboronátové komplexy, které se snadno zachycují na extrakční koloně C18, v alkalickém prostředí se snadno rozrušují a metanefriny se promývají metanolem s pufrem NH₄Cl-NH₄OH a eluují 5 % kyselinou mravenčí. Chromatografie při 40 °C na pentafluorfenylové koloně (zrno 3 µm) s mobilní fází 0,2 % vodní kyselina mravenčí s metanolem. Hmotnostní spektrometrie používá teplotu plynu 325 °C při napětí v kapiláře 3000 V; sledují se adrenalin m/z 170,1 a fragmenty 152,1 a 107 spolu s vnitřním standardem noradrenalinem-D6 m/z 176,1 a jeho fragmentem 158,1. Kalibrace pro adrenalin je 0 – 1000 µg/l. Preciznost v sérii 0,6 – 3,5 %, mezi sériemi 0,6 – 5,4 %; zpětný výtěžek 101,1 – 102,9 %.

Hodnoty snižuje: anorexie, hypotenze; podání α₂-sympatomimetik, antagonisté kalcia (chronické podání), inhibitory angiotensin konvertujícího enzymu, dipidolor, fentanyl, galanin, haemiton, morfin, nifedipin.

Hodnoty zvyšuje: odběr vstoje nebo vsedě (rozdíl 30 – 50 %), požití většího množství masa, kouření (nárůst o 100 %), hypoglykémie, hypotyreóza, akutní infarkt myokardu, diabetická ketoacidóza, elektrokonvulze, fyzická námaha, bolestivé stavy, paragangliom, popáleniny, strach, stres, šok, progresivní svalová dystrofie, feochromocytom, ganglioblastom, ganglioneurom, hladovění, hemodialýza, histamin, menopauza, migréna, vystavení chladu, tyreotoxikóza; léky: adenosin, alfa-metyldopa, ANP, antagonisté kalcia (akutní podání), bronchodilatancia, desipramin, dopamin, etanol, felodipin, fenetrol, furosemid, hydrazin, chinidin, inzulin, izoproterenol, kofein, metoprorol, nit-ret, nitro-mack, nitroprusid sodný, nitroglycerin, prazosin, prostaglandin F (u těhotných), salbutamol, tensamin, teofylin, trimekryton, urandil.