rubella antibodies, german measles antibodies

Pozor i v odborných textech jsou časté záměny rubella (zarděnky) a rubeolla (spalničky).

Odebírá se venózní srážlivá krev bez přídavků. Nezbytný je následný odběr do 30 dnů. Sérum je stabilní za laboratorní teploty 2 – 3 d, při 4 – 8 °C 14 – 21 d, při -20 °C 3 – 12 měsíců. Opakované rozmrazování se nedoporučuje (jiný pramen dovoluje rozmrazování 5x).

Vyšetřují se jak IgG, tak IgM protilátky. Některé postupy (komplement fixační reakce, neutralizační test, latexová aglutinace, hemaglutinační inhibice, nepřímá imunofluorescence) je ale nerozlišují.

Komplement fixační reakce V reakci je pět složek: antigen (buňky králičích nebo křeččích ledvin infikované virem), vyšetřované sérum pacienta, komplement, beraní krvinky, králičí sérum s protilátkami proti beraním krvinkám (tzv. amboceptor). Princip reakce lze popsat ve 4 krocích: smísí se zkoumané sérum, v němž byl inaktivován vlastní komplement a příslušný antigen (pozitivita: vzniknou komplexy antigen-protilátka, negativita: komplexy antigen-protilátka nevzniknou); přidá se morčecí komplement alexin (pozitivita: komplement se vyváže na komplexy antigen-protilátka, negativita: komplement se nevyváže a je nadále aktivní); mimo reakci se připraví tzv. hemolytický systém, tj. ovčí krvinky s navázanými protilátkami proti těmto (zdrojem protilátek je obvykle králičí antisérum proti ovčím krvinkám); do reakce se přidá hemolytický systém (pozitivita: komplement je vyvázán, tedy neaktivní a nedojde k hemolýze, negativita: komplement se vyváže na hemolytický systém tj. vlastně komplexy antigen-protilátka a dojde k hemolýze. Reakce se hodnotí v několika ředěních séra (1:4 až 1:64). Jako výsledek se udává nejvyšší ředění séra (titr), při kterém ještě nedošlo k hemolýze. Reakce je citlivá, ale nelze rozlišit jednotlivé třídy protilátek.

Neutralizační test – sérum se smíchá s kulturou viru Rubella a nechá se inkubovat. Obsahuje-li testované sérum protilátky proti tomuto viru, dojde k vazbě protilátek na receptory viru a jeho inaktivaci. Neobsahuje-li sérum protilátky, virus zůstane aktivní. Inkubovaným roztokem se poté naočkuje buněčná kultura. V pozitivním případě (sérum obsahuje protilátky proti viru) inaktivovaný virus není schopen napadnout buňky a nedojde k vytvoření cytopatického efektu. Je-li sérum negativní, na buněčné kultuře je pod mikroskopem patrný cytopatický efekt. Metoda se obvykle provádí v několika ředěních séra (dvojkovou řadou, obvykle 1:4 až 1:64). Vhodně naředěné sérum se pipetuje do jamek mikrotitračních destiček a inkubuje s virem Rubella v Eagleově médiu (obsahuje aminokyseliny, soli, glukózu a vitaminy) 5 dní při 37 °C. Pak se virus Rubella zamění za Echovirus a výsledek se odečítá za 2 – 4 dny. Cytopaticky efekt vyvolá Echovirus, pokud byl virus Rubella neutralizován. Přidá se suspenze morčecích erytrocytů ve fosfátovém pufru a nechá se adsorbovat 15 min při 4 °C. Pak se promyje fosfátovým pufrem a v místech replikace viru je viditelná hemadsorpce. Při odečítání hemadsorpce může být dosaženo zvýšení citlivosti přidáním směsi 4 % roztoku o-tolidinu v kyselině octové a 10 % H₂O₂ ve fosfátovém pufru. Po 1 – 2 min za laboratorní teploty se vyvine tmavě zelené zbarvení v jamkách obsahujících erytrocyty. Protože o-tolidin je kancerogenní, lze jej nahradit jinými redox indikátory, např. guajakolem nebo tetrametylbenzidinem. Nelze rozlišit jednotlivé třídy protilátek.

Latexová aglutinace je rychlý orientační test, kdy se ke kapce neředěného séra přidá kapka latexové suspenze (latexové částice potažené virem zarděnek). Po promíchání špachtlí v ohraničeném kroužku tvrdé tmavé karty. Karta pak rotuje 8 min na mechanické plošině s krytem a vlhkou houbou, aby se omezilo odpařování. Pak je test odečítán a výsledek je pozitivní, když došlo k aglutinaci latexu.

Hemaglutinační inhibice Principem reakce je inhibice hemaglutinačních účinků antigenu, tj. viru zarděnek. Nutnou podmínkou jsou tedy hemaglutinační schopnosti antigenu. Antigen viru zarděnek se ředí dvojkovou řadou v kónických zkumavkách roztokem obsahujícím CaCl₂, NaCl, MgSO₄ a hovězí albumin. Vzorek séra se smísí se suspenzí kaolinu a inkubuje 20 min při 18 – 25 °C. Po centrifugaci se supernatant odpipetuje do jamek mikrotitračních destiček, přidá se různě ředěný virus zarděnek a inkubuje se 60 min při 15 – 25 °C. Pak se přidají taninované erytrocyty a inkubuje se 3 – 20 h při 18 – 25 °C. Pokud je v séru dostatečná koncentrace specifických protilátek, tyto se naváží na antigen, a inhibují jeho hemaglutinační schopnosti. Většinou se reakce hodnotí pouze kvalitativně a provádí se v několika ředěních séra. Jako výsledek se udává nejvyšší ředění séra dvojkovou řadou (tzv. titr) při kterém ještě nedošlo po 60 min k hemaglutinaci. Popsaná reakce je tzv. přímou reakcí inhibice hemaglutinace. Při testu se nerozlišují protilátky IgG a IgM.

Nepřímá imunofluorescence Nátěr infikovaných buněk byl fixován acetonem a obkroužen rychle schnoucím barvivem. Do jamek destiček byla pipetována analyzovaná séra (ředěná 1:4 až 1:128). Po inkubaci 20 min při 36 °C vypláchnutí a promývání fosfátovým pufrem (3x) byl přidán konjugát fluorescein izotiokyanátu s králičí protilátkou vůči lidským imunoglobulinům. Následovala další inkubace 20 min při 36 °C ve tmě. Pak byly vzorky promyty (2x), překryty glycerolovým médiem s fosfátovým pufrem a analyzovány ve fluorescenčním mikroskopu. Vzorky se hodnotí buď na 1 až 4 kříže, nebo se provádí ředění v dvojkové řadě 1:4 až 1:128 a titr nepřímé fluorescence (excitace 488 nm, emise 530 nm) byla hodnota ředění, při které došlo k fluorescenci hodnocené na 1+.

RIA má pro toto stanovení již jen historický význam. Postup byl zdlouhavý. Na polystyrénové kuličky se nanesl purifikovaný virus zarděnek (laboratorní teplota, adsorpce 16 h). Pak jsou kuličky vysušeny vzduchem a skladovány při 4 °C. Do plastových zkumavek bylo pipetováno sérum ředění fosfátovým pufrem a přidána kulička s antigenem viru. Inkubace při 37 °C 1 h. Po promytí kuliček 2x pitnou vodou se přidal ¹²⁵I-IgG nebo ¹²⁵I-IgM a proběhla inkubace 1 h při 37 °C v médiu Eagle, obohaceném laktalbumin hydrolyzátem, telecím sérem a antibiotiky. Kuličky se opět propláchly 2x pitnou vodou a měřila se radioaktivita precipitátu 1 min gama-počítačem a byla nepřímo úměrná množství protilátek vůči zarděnkám (IgG nebo IgM). Preciznost v sérii byla 7,5 % pro IgG protilátky a 6,2 % pro IgM protilátky.

ELISA IgG umožňuje in vitro semikvantitativní nebo kvantitativní vyšetření na protilátky třídy IgG vůči virům zarděnek v séru nebo plazmě. Reakční jamky mikrotitračních destiček jsou potažené antigenem viru zarděnek. V prvním kroku reakce jsou zředěné vzorky sér inkubovány v jamkách 60 min při 37 °C. V případě pozitivního vzorku se specifické IgG protilátky (také IgM) váží k antigenům. Po promytí pufrem (4x) se k detekci navázaných protilátek provádí následně inkubace 60 min při 37 °C s enzymovým konjugátem (fragment (ab)´ králičí protilátky vůči lidskému IgG značené peroxidázou), který je schopen vyvolat barevnou reakci, následně po promytí pufrem (4x), s přidaným tetrametylbenzidinem a H₂O₂. Po 30 min (za laboratorní teploty ve tmě) se reakce zastaví stop činidlem a intenzita vzniklého zabarvení je přímo úměrná koncentraci IgG protilátek proti antigenům zarděnek. Měření se provádí při 450/615-690 nm do 60 min. Kvantitativní měření na základě pětibodové kalibrace v rozsahu 0 – 200 kU/l. Semikvantitativní výsledky jsou hodnoceny v poměru k absorbanci cutoff kalibrátoru (10 kU/l). Přesnost v sérii 3,1 – 13,7 %, mezi sériemi 3,8 – 14,8 %. Senzitivita: 100 %, specifita: 98,5 %.

ELISA IgM umožňuje in vitro kvalitativní vyšetření na protilátky třídy IgM vůči virům zarděnek v séru nebo plazmě. Aby se předešlo falešně pozitivním výsledkům z důvodu případného vlivu revmatoidních faktorů, provádí se ošetření vzorku pomocí RF absorbentu. Ten na sebe váže IgG protilátky obsažené v testovaném vzorku. Veškeré revmatoidní faktory obsažené ve vzorku se navážou na výsledné imunokomplexy a jsou tak eliminovány. Reakční jamky mikrotitračních destiček jsou potažené antigenem viru zarděnek. V prvním kroku reakce jsou zředěné vzorky sér inkubovány v jamkách 60 min při 37 °C. V případě pozitivního vzorku se specifické IgM protilátky (také IgG) váží k antigenům. Po promytí pufrem (4x) se k detekci navázaných protilátek provádí následně inkubace 60 min při 37 °C s enzymovým konjugátem kozí protilátky vůči lidskému IgM značené peroxidázou), který je schopen vyvolat barevnou reakci, následně po promytí pufrem (4x), s přidaným tetrametylbenzidinem a H₂O₂. Po 30 min (za laboratorní teploty ve tmě) se reakce zastaví stop činidlem a intenzita vzniklého zabarvení je přímo úměrná koncentraci IgM protilátek proti antigenům zarděnek. Měření se provádí při 450/615-690 nm do 60 min. Přesnost v sérii 3,4 – 15,1 %, mezi sériemi 4,6 – 16,2 %. Senzitivita: 98 %, specifita: 97,3 %.

Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) IgG protilátek kvantitativně probíhá tak, že se do reakční nádobky dávkuje vzorek a poté latexové mikročástice potažené virem zarděnek a pufr. Po inkubaci se reakční směs přenese na fritu a nenavázaný materiál se oddělí promytím. Přidá se konjugát protilátek vůči lidskému IgG značený ALP. Po inkubaci a promytí se dávkuje substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí na fluoreskující umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky (excitace 365 nm, emise 448 nm). Šestibodová kalibrace je v rozsahu 0 – 500 kU/l. Vzorky s koncentrací IgG protilátek > 500 kU/l se ředí automaticky 10x. Preciznost v sérii je 6,3 – 9,4 %, celková preciznost metody je 10,8 – 13,8 %. Relativní senzitivita 99,1 %, relativní specificita 87,4 %.

Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) IgM protilátek kvalitativně probíhá tak, že se vzorek naředí s pufrem pro neutralizaci revmatoidního faktoru a do reakční nádobky se dávkuje upravený vzorek a poté latexové mikročástice potažené virem zarděnek. Po inkubaci se reakční směs přenese na fritu a nenavázaný materiál se oddělí promytím. Přidá se konjugát protilátek vůči lidskému IgM značený ALP. Po inkubaci a promytí se dávkuje substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí na fluoreskující umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky (excitace 365 nm, emise 448 nm). Pro kvalitativní hodnocení se používá indexový kalibrátor. Vzorky s indexem < 0,6 vůči kalibrátoru jsou negativní, > 0,8 jsou pozitivní a mezi těmito hodnotami jsou neurčité na přítomnost IgM protilátek vůči zarděnkám. Preciznost v sérii je 3,7 – 6,7 %, celková preciznost metody je 7,2 – 19,7 %. Relativní senzitivita 89,2 %, relativní specificita 98,8 %.

Chemiluminiscenční analýza IgG protilátek v dvojstupňovém sendvičovém uspořádání používá paramagnetické částice potažené antigenem zarděnek, na který se naváží protilátky ze vzorku. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá konjugát myších monoklonálních protilátek vůči lidskému IgG s akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je přímo úměrná hladině IgG protilátek a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Šestibodová kalibrace je v rozsahu 1,2 – 500 kU/l. Preciznost v sérii je 3,7 – 15,1 %, celkově 6,2 – 17,0 %. Funkční senzitivita je 1,2 kU/l. Relativní senzitivita je 97,4 %, relativní specificita 96,3 %.

Podobný princip zábleskové luminiscence v sendvičovém uspořádání lze použít s esterem akridinu jako značkou pro IgG protilátky vůči zarděnkám. Ke vzorku se přidají paramagnetické latexové částice potažené monoklonální protilátkou vůči Fc fragmentu lidského IgG, antigen zarděnek značený esterem akridinu a inkubuje 18 min při 37 °C. Následuje odsátí roztoku a promytí zkumavek, přidá se peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk (intenzita signálu je přímo úměrná množství IgG protilátek) fotonásobičem při 429 nm. Na základě dvoubodové kalibrace jsou vzorky s koncentrací < 5 kU/l negativní, 5 – 9,99 kU/l neurčité a ≥ 10 kU/l pozitivní na IgG protilátky vůči zarděnkám. Preciznost v sérii je 1,5 – 3,2 %, celkově 2,2 – 7,2 %. Relativní senzitivita je 99,4 %, relativní specificita 98,8 %. Koncentrace hemoglobinu 5 g/l, triacylglycerolů 11,3 mmol/l a bilirubinu 684 µmol/l interferují ≤ 10 %. Zvýšené koncentrace IgG mohou snižovat výsledky, což se projeví zejména v intervalu 10 – 15 kU/l.

Podobný princip zábleskové luminiscence v sendvičovém uspořádání lze použít s esterem akridinu jako značkou pro IgM protilátky vůči zarděnkám. Ke vzorku se přidají paramagnetické latexové částice potažené monoklonální protilátkou vůči Fc fragmentu lidského IgM a inkubuje 18 min při 37 °C. Následuje odsátí roztoku a promytí zkumavek; přidá se antigen zarděnek značený esterem akridinu a inkubuje 18 min při 37 °C. Následuje odsátí roztoku a promytí zkumavek, přidá se peroxid vodíku + roztok NaOH a ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk (intenzita signálu je přímo úměrná množství IgM protilátek) fotonásobičem při 429 nm. Na základě dvoubodové kalibrace se určí hodnota cutoff. Vzorky s indexem < 0,8 jsou negativní, 0,8 – 0,99 jsou neurčité a ≥ 1,0 jsou pozitivní na IgM protilátky vůči zarděnkám. Preciznost v sérii je 3,3 – 4,6 %, celkově 4,4 – 6,2 %. Relativní senzitivita je 91,0 %, relativní specificita 91,1 %. Koncentrace hemoglobinu 5 g/l, triacylglycerolů 11,3 mmol/l a bilirubinu 684 µmol/l interferují ≤ 10 %.

CLIA je další sendvičový zábleskový postup, kdy se IgG protilátky (také IgM protilátky) ze vzorku naváží během inkubace na magnetické částice potažené virem zarděnek. Po promytí se přidají myší monoklonální protilátky vůči lidskému IgG značené izoluminolem a provede se další inkubace. Celková doba inkubace je 20 min. Po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je přímo úměrná hladině protilátek IgG vůči zarděnkám. Dvoubodová kalibrace se provede v tripletu pro rozsah měření IgG protilátek 3 – 350 kU/l. Cutoff  hodnota je 10 kU/l. Preciznost v sérii 4,4 – 14,1 %, mezi sériemi 3,8 – 11,5 %; linearita ředění 74,5 – 105 %. Relativní senzitivita je 99,3 %, relativní specificita 94,2 %. Ani koncentrace hemoglobinu 10 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší.

CLIA je další sendvičový zábleskový postup, kdy se IgM protilátky (také IgG protilátky) ze vzorku naváží během inkubace na magnetické částice potažené myšími monoklonálními IgG protilátkami vůči lidskému IgM. Po promytí se přidá virus zarděnek a proběhne druhá inkubace. Konečně se přidá konjugát myší monoklonální protilátky vůči viru zarděnek s izoluminolem a provede se další inkubace. Celková doba inkubace je 30 min. Po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je přímo úměrná hladině protilátek IgM vůči zarděnkám. Dvoubodová kalibrace se provede v tripletu pro rozsah měření IgM protilátek 10 – 400 kU/l. Cutoff  hodnota je 20 kU/l. Preciznost v sérii 3,4 – 8,5 %, mezi sériemi 7,3 – 13,4 %; linearita ředění 83,3 – 132,9 %. Relativní senzitivita je 95,9 %, relativní specificita 97,5 %. Ani koncentrace hemoglobinu 10 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší.

Jiné stanovení IgG protilátek vůči zarděnkám je založeno na sendvičové imunochemické reakci se sledováním luminiscence zesílené enzymem. Protilátky vůči zarděnkám ze vzorku se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váží na virus zarděnek imobilizovaný na polystyrénové kuličce. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytím se na druhé vazebné místo viru naváže myší monoklonální protilátka vůči lidskému IgG konjugovaná s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření 425 – 500 nm je přímo úměrná koncentraci IgG protilátek vůči zarděnkám ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Rozsah kalibrace je 5 – 400 kU/l. Analytická citlivost je 5 kU/l. Vzorky s koncentrací IgG protilátek < 5 kU/l se považují za nereaktivní, 5 – < 10 kU/l jsou neurčité a ≥ 10 kU/l jsou reaktivní na IgG protilátky vůči zarděnkám. Preciznost v sérii 5,2 – 9,3 %, mezi sériemi 5,3 – 9,4 %. Relativní senzitivita je 98,8 %, relativní specificita 90,4 %. Ani koncentrace hemoglobinu 5,4 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší. Heterofilní protilátky mohou ovlivňovat výsledky analýzy.

Jiný průkaz IgM protilátek vůči zarděnkám je založen na sendvičové imunochemické reakci se sledováním luminiscence zesílené enzymem. Protilátky vůči zarděnkám ze vzorku se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váží na virus zarděnek imobilizovaný na polystyrénové kuličce. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytím se na druhé vazebné místo viru naváže kozí polyklonální protilátka vůči lidskému IgM konjugovaná s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření 425 – 500 nm je přímo úměrná koncentraci IgM protilátek vůči zarděnkám ve vyšetřovaném vzorku. Cutoff hodnota se získá z průměru dubletu výsledků pro kalibrátor. Vzorky s koncentrací IgM protilátek < 0,9 cutoff se považují za nereaktivní, 0,9 – < 1,1 cutoff jsou neurčité a ≥ 1,1 cutoff jsou reaktivní na IgM protilátky vůči zarděnkám. Preciznost v sérii 4,4 – 8,1 %, celkem 6,5 – 9,6 %. Relativní senzitivita je 84 %, relativní specificita 99 %. Ani koncentrace hemoglobinu 5,4 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší. Heterofilní protilátky mohou ovlivňovat výsledky analýzy.

Další postup ke stanovení IgG protilátek používá podobný luminogen Lumi-Phos 530 v dvojstupňové reakci. Do zkumavky se pipetují paramagnetické částice potažené virem zarděnek a standard nebo vzorek. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Během druhé inkubace se přidá myší monoklonální protilátka vůči lidskému IgG značená ALP. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky.  Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je přímo úměrné množství IgG protilátek vůči zarděnkám. Cutoff je 15 kU/l. Vzorky s koncentrací IgG protilátek < 10 kU/l se považují za nereaktivní, 10 – < 15 kU/l jsou neurčité a ≥ 15 kU/l jsou reaktivní na IgG protilátky vůči zarděnkám. Rozsah měření je 10 – 500 kU/l. Preciznost v sérii 3,2 – 14,8 %, mezi sériemi 5,4 – 14,6 %. Relativní senzitivita je 96 %, specificita je 99 %. Vysoké koncentrace hemoglobinu (20 g/l), bilirubinu (342 µmol/l) a triacylglycerolů (40,7 mmol/l) neruší při analýze.

Další postup k průkazu IgM protilátek používá podobný luminogen Lumi-Phos 530 v dvojstupňové reakci. Do zkumavky se pipetují paramagnetické částice potažené ovčí polyklonální protilátkou vůči lidskému IgM a standard nebo vzorek. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Během druhé inkubace se přidá komplex viru zarděnek a myší monoklonální protilátky vůči zarděnkám značené ALP. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky.  Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je přímo úměrné množství IgM protilátek vůči zarděnkám. Doba analýzy je 75 min. Cutoff je 15 kAU/l (arbitrární jednotky!). Vzorky s koncentrací IgM < 10 kAU/l se považují za nereaktivní, 10 – < 15 kAU/l jsou neurčité a ≥ 15 kAU/l jsou reaktivní na IgG protilátky vůči zarděnkám. Rozsah měření je 0 – 60 kAU/l. Preciznost v sérii 3,6 – 10,4 %, mezi sériemi 4,1 – 10,2 %. Relativní senzitivita je 95,6 %, specificita je 98,7 %. Silná hemolýza a zákal ruší při analýze.

Chemiluminiscenční analýza IgG protilátek v dvojstupňovém sendvičovém kvantitativním provedení, kdy se protilátky vůči zarděnkám ze vzorku váží na virus zarděnek, kterým jsou potaženy jamky mikrotitrační destičky. Po inkubaci (37 °C) se promytím odstraní volný materiál a přidá se myší monoklonální protilátka vůči lidskému IgG značená křenovou peroxidázou. Po inkubaci (37 °C) se promytím odstraní volný materiál a přidá se luminogen (derivát luminolu + sůl peroxykyseliny) jehož oxidaci katalyzuje POD za vzniku světla. Celkově trvá inkubace 24 min a první výsledek je k dispozici za 35 min. Činidlo pro přenos elektronů (substituovaný acetanilid) zvyšuje hladinu uvolněného světla a prodlužuje jeho emisi. Signál je přímo úměrný koncentraci IgG protilátek vůči zarděnkám ve vzorku. Kalibrační křivka se adjustuje ze vzorové křivky po analýze tří kalibrátorů. Měřící rozsah je 0,58 – 350 kU/l IgG protilátek. Detekční limit je 0,58 kU/l IgG protilátek. Vzorky s koncentrací IgG protilátek < 10 kU/l se považují za nereaktivní, 10 – 14,9 kU/l jsou neurčité a ≥ 15 kU/l jsou reaktivní na IgG protilátky vůči zarděnkám. Preciznost v sérii 2,3 – 6,5 %, mezi sériemi je 4,7 – 20,8 %. Relativní senzitivita je 97,5 %, relativní specificita 94,6 %. Vysoké koncentrace hemoglobinu (5 g/l), bilirubinu (342 µmol/l) a triacylglycerolů (33,9 mmol/l) neruší při analýze. Nelze použít zakalené vzorky. Heterofilní protilátky mohou ovlivňovat výsledky analýzy.

Chemiluminiscenční analýza IgM protilátek v dvojstupňovém sendvičovém kvalitativním provedení, kdy se IgM ze vzorku váží na biotinylovanou myší IgM protilátku, která se zachytí na streptavidin v jamkách mikrotitrační destičky. Po inkubaci (37 °C) se promytím odstraní volný materiál a přidá se konjugát viru zarděnek s myší monoklonální protilátkou vůči viru zarděnek, značenou křenovou peroxidázou. Po inkubaci (37 °C) se promytím odstraní volný materiál a přidá se luminogen (derivát luminolu + sůl peroxykyseliny) jehož oxidaci katalyzuje POD za vzniku světla. Celkově trvá inkubace 32 min a první výsledek je k dispozici za 43 min. Činidlo pro přenos elektronů (substituovaný acetanilid) zvyšuje hladinu uvolněného světla a prodlužuje jeho emisi. Signál je přímo úměrný koncentraci IgM protilátek vůči zarděnkám ve vzorku. Cutoff hodnota se určí měřením jednoho kalibrátoru v dubletu a násobí se faktorem specifickým pro danou šarži reagencií. Vzorky s koncentrací IgM protilátek < 0,8 cutoff se považují za negativní, ≥ 0,8 – < 1,2 cutoff jsou hraniční a ≥ 1,2 cutoff jsou reaktivní na IgM protilátky vůči zarděnkám. Preciznost v sérii 1,4 – 14,8 %, mezi sériemi je 1,8 – 17,8 %. Relativní senzitivita je 96,8 %, relativní specificita 96,1 %. Vysoké koncentrace hemoglobinu (5 g/l), bilirubinu (342 µmol/l) a triacylglycerolů (33,9 mmol/l) neruší při analýze. Nelze použít zakalené vzorky. Heterofilní protilátky mohou ovlivňovat výsledky analýzy. Hladina biotinu v séru je zvýšená až 24 h od jeho podání.

Stanovení IgG protilátek elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (10 µl) je inkubován s biotinylovanou monoklonální myší protilátkou vůči lidskému IgG, fragmentem monoklonální myší protilátky vůči zarděnkám značeným ruthéniovým komplexem, biotinylovaným rekombinantním virem zarděnek a virem zarděnek značeným ruthéniovým komplexem. Pak se přidají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem, na které se naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Po inkubaci se reakční směs nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Luminiscence je přímo úměrná hladině IgG protilátek vůči zarděnkám ve vzorku. Provádí se dvoubodová kalibrace a na jejím základě se adjustuje kalibrační křivka v rozsahu 0,17 – 500 kU/l IgG protilátek (vyšší koncentrace se ředí 20x). Detekční limit je 0,17 kU/l. Vzorky s koncentrací IgG protilátek < 10 kU/l se považují za nereaktivní a ≥ 10 kU/l jsou reaktivní na IgG protilátky vůči zarděnkám. Preciznost v sérii 1,1 – 3,0 %, mezi sériemi 3,2 – 6,4 %. Relativní senzitivita 97,5 %, relativní specificita je 96,2 %. Hemolýza (hemoglobin 56 g/l), chylozita (triacylglyceroly 16,9 mmol/l), ikterus (bilirubin 513 µmol/l) a RF (< 6210 kIU/l) neruší. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměli odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Vzácně mohou interferovat protilátky vůči streptavidinu nebo rutheniu.

Průkaz IgM protilátek elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (10 µl) je inkubován s biotinylovanou monoklonální myší protilátkou vůči lidskému IgM a rekombinantním virem zarděnek. Pak se přidají monoklonální myší protilátky vůči zarděnkám značené ruthéniovým komplexem a paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem, na které se naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Po inkubaci se reakční směs nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Luminiscence je přímo úměrná hladině IgM protilátek vůči zarděnkám ve vzorku. Provádí se dvoubodová kalibrace a na jejím základě se vypočítá cutoff. Vzorky s koncentrací IgM protilátek < 0,8 cutoff se považují za nereaktivní, 0,8 – < 1,0 cutoff za neurčité a ≥ 1,0 cutoff jsou reaktivní na IgM protilátky vůči zarděnkám. Preciznost v sérii 1,0 – 2,4 %, mezi sériemi 1,9 – 10,9 %. Relativní senzitivita 87 %, relativní specificita je 97,6 %. Hemolýza (hemoglobin 24 g/l), chylozita (triacylglyceroly 16,9 mmol/l), ikterus (bilirubin 428 µmol/l) a RF (< 6210 kIU/l) neruší. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměli odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Vzácně mohou interferovat protilátky vůči streptavidinu nebo rutheniu.

Mezinárodní standard: 1. International Standard for Anti-Rubella Immunoglobulin, human, kód RUBI-1-94, National Institute for Biological Standards and Control, Hertfordshire, UK.

Falešně pozitivní hodnoty při zkřížené reaktivitě s jinými virovými antigeny.