Protilátky vůči chřipkovému viru B, anti-flu B

Odebírá se venosní srážlivá krev ráno nalačno. Odběr je nutné opakovat za 10 – 14 dní. Sérum je stabilní 2 d při 15 – 25 °C, 14 d při 4 – 8 °C, 1 rok při -20 °C. K analýze lze použít i plazmu (antikoagulans EDTA, heparin nebo citrát). Vyloučit je třeba opakované rozmrazení.

Imunodifuze v agarovém gelu může být využita k průkazu cirkulujících protilátek vůči antigenu influenza typu B. Základem testu je migrace antigenu a protilátek proti sobě v matrici agarového gelu. Když se dostanou obě složky do vzájemného kontaktu, vzniká precipitát, který se zachytí v gelové matrici a vytvoří viditelný pruh. Rozdíly ve vzájemných koncentracích obou složek vedou k posunu tohoto pruhu vzhledem ke startu, až při nejnižších koncentrací nevzniká žádná precipitační linie. Tvorbu precipitátu také ovlivňuje koncentrace elektrolytu, pH, teplota a další faktory. Imunodifuze se provádí v Petriho misce tak, aby tlouš
eka agaru byla přibližně 2,8 mm. Pomocí šablony se vyřežou pláty 100x15 mm až pro 7 vzorků (nebo 60x15 mm pro 2 vzorky). V gelu se vyhloubí 12 – 14 jamek. Do centrální jamky se pipetuje virus influenza B, další 3 jamky jsou pozitivní kontroly a 3 jsou vzorky. Inkubace probíhá 24 h za laboratorní teploty v uzavřené komůrce. Pozitivní vzorky vytvářejí souvislou precipitační linii mezi jamkami pro antigen a protilátku a její poloha závisí na množství protilátky (čím je protilátky více, tím je precipitační linie vzdálenější od jamky s protilátkou).

Fixace komplementu je semikvantitativní test, při kterém řada malých bílkovin reaguje s komplexem antigenu viru influenza B i jeho protilátek. Napřed se tepelně denaturuje komplement séra a přidá se standardní množství morčecího komplementu. Dále se přidá antigen viru influenza B. Pokud nejsou přítomné protilátky vůči tomuto antigenu, dochází k lýze přidaných ovčích erytrocytů komplementem a vzniká růžové zbarvení. Pokud jsou protilátky přítomné, vytvoří imunokomplex s antigenem influenza B, ten vyváže komplement a vzniká sraženina. Proto nedochází k lýze ovčích erytrocytů (volný komplement není v dispozici). Při testu se nerozlišují protilátky IgG, IgA a IgM. Provede se postupné ředění dvojkovou řadou a hodnotí se nejvyšší titr, kdyještě vzniká růžové zbarvení.

Nepřímá hemaglutinace používá taninované erytrocyty s citlivostí vůči viru influenza B. Virus se nechá působit 15 min při 37 °C. Pak se buňky 2x promyjí fosfátovým pufrem obsahujícím 1 % králičího séra a naředí se nakonec na 1 % buněčného obsahu. Provede se postupné ředění dvojkovou řadou a hodnotí se nejvyšší titr, kdy po 90 min se ještě objeví aglutinace. Při testu se nerozlišují protilátky IgG a IgM. Nepřímá hemaglutinace je citlivější než fixace komplementu při průkazu protilátek vůči viru influenza B.

ELISA je k dispozici jak pro kvalitativní, tak pro kvantitativní stanovení. Soupravy umožňují stanovení protilátek třídy IgG, IgA nebo IgM. V případě stanovení protilátek IgM je nutné sérum upravit reakcí se speciálním absorbentem pro revmatoidní faktor. Revmatoidní faktor obsahuje nespecifické IgM autoprotilátky, které mohou vyvolat falešně pozitivní reakci na IgM protilátky vůči viru influenza B. Může také dojít k tomu, že vlivem RF budou stanovované protilátky vytlačované z vazby na virus protilátkami IgG, které mají silnější vazbu a výsledkem bude falešně nižší hodnota IgM protilátek vůči viru influenza B.

Kvantitativní stanovení protilátek (IgG, IgA nebo IgM) vůči viru influenza B je zahájeno pipetováním ředěného vzorku do mikrotitrační destičky s jamkami potaženými virem influenza B. Po inkubaci 60 min při 37 °C se jamky promyjí 4x a přidá se konjugát polyklonální kozí protilátky vůči lidskému IgG, IgA nebo IgM s alkalickou fosfatázou. Po inkubaci 30 min při 37 °C se jamky promyjí 4x a přidá se roztok p-nitrofenylfosfátu. Po inkubaci 30 min při 37 °C se přidá stop činidlo (1,2 M NaOH) a provede se měření při 405/620-690 nm do 1 h. Kalibrace využívá logit-log čtyřparametrový model a je adjustována jedním kalibrátorem (stanovení v dubletu). Výsledky jsou uváděny v kU/l.

Jiná ELISA používá mikrotitrační destičky s jamkami potaženými virem influenza B. Po inkubaci 60 min při 37 °C se jamky promyjí 4x a přidá se konjugát protilátky vůči IgG, IgA nebo IgM s křenovou peroxidázou. Po inkubaci 30 min za laboratorní teploty ve tmě se jamky promyjí 4x a přidá se roztok tetrametylbenzidinu. Po inkubaci 15 min za laboratorní teploty ve tmě se přidá stop činidlo a provede se měření při 450/620 nm do 30 min. Kvalitativní hodnocení se provádí tak, že se stanové absorbance cutoff a výsledky > cutoff + 10 % jsou pozitivní, výsledky < cutoff – 10 % jsou negativní, ostatní jsou považovány za neurčité. Preciznost v sérii (pro IgG protilátky) je 3,4 %, mezi sériemi 3,2 %. Relativní citlivost je 95,8 %, relativní specifita 86,7 %. Analýzu neruší hemoglobin 10 g/l, triacylglyceroly 5,65 mmol/l, bilirubin 342 µmol/l.

V dostupné literatuře nejsou uvedené.