5-hydroxytryptamin, 5-HT;

enteramine, thrombocytin, 3-(β-aminoethyl)-5-hydroxyindol, thrombotonin;

systematický název: 5-hydroxytryptamin nebo 3-(2-aminoethyl)-1H-indol-5-ol.

Odběr do EDTA a kyseliny askorbové, ihned promíchat, transport v chladu, do 2 h oddělit plazmu. Krev je stabilní 2 h na ledu, plazma při 4 – 8 °C 8 – 24 h, při -20 °C 6 – 12 měsíců. 98 % serotoninu je vázáno na trombocyty a uvolňuje se během srážení. Srážlivá krev není k vyšetření vhodná. V předchozí stravě po tři dny vyloučit indoly (avokádo, banán, rajče, vlašské ořechy, švestky, ananas, lilek), tabákové výrobky, čaj, kávu. Maximální hodnoty jsou v létě, minimální v zimě. Serotonin se také může stanovovat v moči, likvoru a trombocytech. Moč se okyselí 6 M HCl. Po zamrazení lze uchovávat při -20 °C 6 měsíců. Opakované rozmrazování se nedoporučuje.

Přepočet µg/l x 5,67 = nmol/l

RIA Serotonin je kvantitativně acylován acylačním činidlem v acylačním pufru (30 min, 20 – 25 °C). Pak se uplatňuje kompetitivní postup, kdy vzorky a kalibrátory jsou inkubovány 90 min (2 – 8 °C) s ¹²⁵I-serotoninem a 5-HT králičím antisérem. Po inkubaci se přidá precipitační činidlo (kozí antisérum vůči králičímu séru v polyetylenglykolu a fosfátovém pufru), zamíchá se a inkubuje 15 min při 2 – 8 °C. Po centrifugaci se supernatant dekantuje, nechá odkapat a radioaktivita precipitátu se měří gama-počítačem (1 min). Signál je nepřímo úměrný koncentraci serotoninu ve vzorku. Rozsah měření na základě šestibodové kalibrace 38 – 14175 nmol/l. Analytická citlivost je 38 nmol/l (jiná souprava uvádí 113 nmol/l). Preciznost v sérii je 4,2 – 4,8 %, mezi sériemi 4,6 – 5,6 %; zpětný výtěžek 82 – 112 %, linearita ředění 89 – 116 %. Hemolytická a zejména lipemické vzorky nejsou vhodné pro analýzu.

ELISA Serotonin je kvantitativně acylován acylačním činidlem v acylačním pufru (30 min, 18 – 25 °C ve tmě). Pak se uplatňuje kompetitivní postup na mikrotitračních destičkách, který používá zakotvenou protilátku vůči serotoninu a do jamek se přidává vzorek nebo kalibrátor a konjugát serotoninu s acetylcholinesterázou. Po inkubaci 180 min (18 – 25 °C, třepání ve tmě) a promytí 3x se přidá substrát. Roztok se inkubuje 15 – 20 min (18 – 25 °C, třepání ve tmě), pak se pipetuje inhibiční činidlo. Absorbance při 405 nm se měří do 20 min a je nepřímo úměrná koncentraci serotoninu ve vzorku. Na základě šestibodové kalibrace je rozsah metody 10 – 4000 nmol/l (moč do 10000 nmol/l). Analytická citlivost je 10 nmol/l (moč 25 nmol/l). Preciznost v sérii je 7,9 – 14,5 %, mezi sériemi 6,2 – 11,5 %. Ruší nahnědlé interferenty a turbidita.

Jiný postup nevyžaduje úvodní acylaci a používá jamky potažené kozí protilátkou vůči králičímu IgG. Ke vzorku se přidává serotonin značený ALP a polyklonální králičí protilátka vůči serotoninu. Po inkubaci 120 min (laboratorní teplota, třepání) a promytí (3x) se přidává p-nitrofenylfosfát (inkubace 60 min, laboratorní teplota) a po zastavení enzymové reakce alkalizaci se měří absorbance při 405/570-590 nm. Signál je nepřímo úměrný množství serotoninu ve vzorku. Rozsah metody je do 2835 nmol/l. Preciznost v sérii je 4,2 – 11,0 %, mezi sériemi 12,7 – 18,7 %; zpětný výtěžek 83 – 102 %, linearita ředění 73 – 115 %. N-acetylserotonin má křížovou reaktivitu 17 %. Jiná varianta s ALP markerem používá v úvodu acylační činidlo (acetanhydrid + aceton). V kompetici se uplatňuje serotonin značený biotinem. Navázání ALP se uskuteční až po ukončení kompetitivní imunoreakce a promytí prostřednictvím protilátky vůči biotinu značené ALP.

Použití POD značky je také komerčně dostupné. V úvodu je acylace 15 min za laboratorní teploty (třepání). Používají se jamky potažené kozí protilátkou vůči králičímu IgG. Přidá se acylovaný vzorek a polyklonální králičí protilátka vůči serotoninu. Směs se inkubuje 30 min za laboratorní teploty (třepání). Po promytí (3x) se přidá konjugát protilátky vůči králičímu IgG s POD. Směs se inkubuje 15 min za laboratorní teploty (třepání). Po promytí (3x) se přidá tetrametylbenzidin a inkubuje se 15 min za laboratorní teploty (třepání). Pak se přidá stop činidlo (0,25 M H₂SO₄) a měří se do 10 min při 450/620-650 nm. Rozsah měření na základě šesti kalibrátorů do 28 – 14175 nmol/l. Preciznost v sérii je 3,9 – 5,4 %, mezi sériemi 6,0 %; zpětný výtěžek 87 – 102 %, linearita ředění 92 – 112 %.

GC-MS používá kapilární plynovou chromatografii s připojením na hmotnostní spektrometr s iontovou pastí. Kolona 15 m se světlostí 25 mm je potažena 0,25 mm filmem (5-fenyl)metylpolysiloxanu. Nosným plynem je helium s průtokem 1 ml/min. Gradient teploty 100 – 300 °C stoupá rychlostí 20 °C/min (při 250 °C je prodleva 5 min). Teplota iontového zdroje je 275 °C a sledují se kolize m/z 50 – 500. Selektivní monitorování iontů (SIM) dovoluje měření v rozsahu 20 – 235 nmol/l se zpětným výtěžkem 98,1 – 102,7 %. 

HPLC vzorek byl ekvilibrován 0,1 M CH₃COOH a na reverzní fázi eluován 10 min (1 ml/min), pak ve stoupajícím gradientu metanolu (0 – 100 % 40 min) a klesajícím gradientu metanolu (100 – 0 %) 10 min. K měření se použil UV detektor 280 nm.

Jinou variantou je použití vodného roztoku kyseliny citronové, jako mobilní fáze, na koloně C18 (velikost zrna 5 µm) nebo jako mobilní fáze 80 % fosfátového pufru (s příměsí oktylsulfátu sodného) a 20 % metanolu – retenční čas serotoninu je 8,8 min) s fluorimetrickou detekcí (excitace 280 nm, emise 340 nm).

HPLC s elektrochemickou detekcí používá kationově-výměnné chromatografie a jako mobilní fáze 0,1 % vodný roztok octanu sodného s metanolem (85:15) a pH 4,2 (průtok 1,2 ml/min). Vzorek plazmy byl před nástřikem deproteinován kyselinou trichloroctovou s přídavkem disiřičitanu sodného a odstředěn. Potenciál elektrochemického detektoru je +0,6 V proti Ag/AgCl elektrodě. Mez detekce je 5 nmol/l, rozsah měření do 10000 nmol/l. Preciznost v sérii 5,6 – 7,8 %, mezi sériemi 3,5 – 14,9 %; zpětný výtěžek 77,3 – 111,2 %.

LC-MS/MS používá k rozdělení analytů gradient rozpouštědel. Prvních 5 min se eluovalo 0,1 % vodným roztokem kyseliny mravenčí. Dalších 5 min se zvyšoval podíl acetonitrilu do 35 %. Tato koncentrace se používala ještě dalších 5 min a pak se vrátila eluce 0,1 % kyselinou mravenčí na 7 min. První kvadrupól vybíral protonizované molekulární ionty M⁺ a fragmentace bylo dosaženo v kolizní cele pomocí argonu energií -16 V. Tak vznikaly sekundární ionty, které byly vybírány v třetím kvadrupólu. Pro serotonin byl m/z 177 a jeho fragment bez amoniaku m/z 160. Detekční limit pro serotonin je 28 nmol/l. Preciznost v sérii 1,25 %, mezi sériemi 10,3 %; zpětný výtěžek 95,4 %.

Hodnoty snižuje: menstruace (v prvních dnech cyklu), obezita, migréna; léky: ranitidin, reserpin.

Hodnoty zvyšuje: období ovulace, stanovení v séru, nedodržení poměru krve a antikoagulancia, karcinoid; léky: estrogeny, inhibitory monoaminooxidázy, metokarbamol.