choriogonadotropin – volná beta podjednotka;

free beta-human chorionic gonadotropin, free chorionic gonadotropin beta subunit, free hCG-b; free beta-HCG; free beta-HCG protein, free b-HCG protein

Stanovení se provádí v séru, plazmě (antikoagulans EDTA, heparin nebo citronan) nebo moči. Stanovení v séru vyžaduje rychlé zpracování (při 15 – 25 °C po 48 h vzestup o 10 – 20 %), případně stabilizaci jodacetátem sodným (5 mmol/l), kdy je hodnota free beta-hCG stálá až 72 h. Stabilita v séru: 1 – 9 d při 4 °C, 3 měsíce při -28 °C. Jinde uveden (Young) vzestup v celé krvi při 4 °C: 2d 10 %, 3d 10 – 20 %, 5d 15 – 40 %.

IRMA volné β-podjednotky hCG je založeno na dvoukrokové sendvičové metodě. Systém používá dvě myší monoklonální protilátky proti dvěma různým epitopům přístupným pouze na volné β-podjednotce molekuly hCG, které si vzájemně nekonkurují. Nejprve se ve zkumavkách potažených první monoklonální protilátkou inkubují vzorky nebo kalibrátory ve fosfátovém pufru (1 h, třepání). Po inkubaci se obsah zkumavek odsaje a pipetuje se do nich druhá protilátka značená ¹²⁵I. Po druhé inkubaci (30 min, třepání) se odsaje obsah zkumavek a vymyje se nenavázaná značená protilátka. Vázaná aktivita ¹²⁵I se měří na gama-počítači (1 min). Celý postup probíhá za laboratorní teploty. Sestrojí se šestibodová kalibrační křivka a hodnoty volného β-hCG přítomné ve vzorcích se odečtou z této křivky. Koncentrace volného β-hCG ve vzorcích je přímo úměrná změřené radioaktivitě. Rozsah metody 0,05 – 200 µg/l. Analytická citlivost 0,05 µg/L, funkční citlivost 0,15 µg/l. Preciznost v sérii ≤ 3,7 %, mezi sériemi ≤ 4,2 %; linearita ředění 81 – 107 %, zpětný výtěžek 77 – 118 %.

ELISA v sendvičovém uspořádání probíhá v mikrotitrační destičce se zakotvenou monoklonální myší protilátkou vůči free β-hCG. Do jamky se přidá standard nebo vzorek a inkubuje se 30 min při 37 °C. Následuje 5x promytí a pak se přidá králičí protilátka (některé soupravy používají monoklonální myší protilátku) vůči free β-hCG s navázanou křenovou peroxidázou. Po inkubaci 30 min při 37 °C (obě inkubace v některých soupravách trvají dvojnásobnou dobu) a promytí 5x se přidá chromogen tetrametylbenzidin a reakce probíhající 20 min je zastavena stop činidlem (0,5 M H₂SO₄). Měření se provádí při 450±10 nm do 15 min. Ruší silná hemolýza a projevuje se efekt nadbytku antigenu. Neruší vysoké koncentrace triacylglycerolů, bilirubinu ani triacylglycerolů. Rozsah měření na základě šestibodové kalibrace je 0,2 – 200 µg/l. Analytická citlivost je 0,2 µg/l. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 19800 µg/l. Preciznost v sérii je 5,8 – 6,9 %, mezi sériemi 6,7 – 8,0 %. Linearita ředění 92,9 – 113,0 %, zpětný výtěžek 86,2 – 109,4 %.

Zesílená fluorescence rozložená v čase je označována jako TRACE (time resolved amplified cryptate emission), kdy se měří fluorescenční signál se zpožděním v homogenním prostředí. Donor (MAb-Eu³⁺ v micele) po ozáření dusíkovým laserem 337 nm emituje světlo 620 nm s dlouhou životností (ms), akceptor (MAb-sběrný protein) generuje signál 665 nm s krátkou životností (ns). Jestliže jsou obě složky v imunokomplexu, pak dochází v imunokomplexu k zesílení signálu a prodloužení jeho životnosti. Sendvičová reakce probíhá 19 min mezi free β-hCG ze vzorku, monoklonální protilátkou vůči free β-hCG značenou Eu³⁺ a monoklonální protilátkou vůči free β-hCG, která je připojena na sběrný protein. Měřený signál je po sendvičové imunoreakci (připojení obou značených monoklonálních protilátek k free β-hCG) přímo úměrný hladině free β-hCG. Analytická citlivost je 0,16 µg/l, funkční citlivost 0,5 µg/l. Na základě jednobodové kalibrace je rozsah měření 0,16 – 150 µg/l, po automatickém ředění až 50000 µg/l. Preciznost pro koncentrace ≥ 0,5 µg/l: v sérii 2 – 10 %, mezi sériemi 3 – 15 %. Hemolýza, chylozita a ikterus neruší, pokud jsou výsledky > 5 µg/l free β-hCG.

DELFIA je heterogenní fluorescenční imunoanalýza, kde prodloužená fluorescence Eu³⁺ je zesílena speciálním roztokem, který uvolňuje Eu³⁺ do roztoku a současně tvoří jeho ochranný chelát. Komerčně dostupná je souprava umožňující současně stanovovat AFP i free β-hCG. Mikrotitrační destičky jsou potaženy směsí protilátek proti AFP a free β-hCG. Po pipetování vzorku se přidají protilátky vůči AFP značené Eu³⁺ a  free β-hCG značené Sm³⁺. Po inkubaci (1 h, třepání, laboratorní teplota) následuje promytí, pak se přidá zesilovací roztok a třepe se 5 min za laboratorní teploty. Fluorescence (Eu³⁺ emise 613 nm, Sm³⁺ emise 643 nm) je přímo úměrná koncentraci analytů ve vzorku a měří se do 1 h. Na základě sedmibodové kalibrace je rozsah metody 1 – 500 kU/l AFP, 1 – 200 µg/l free β-hCG. Analytická senzitivita je pro AFP 0,1 kU/l, pro free β-hCG 0,2 µg/l. Preciznost v sérii AFP 2,9 – 5,7 %; free β-hCG 2,0 – 14,6 %. Preciznost mezi sériemi AFP 3,0 – 4,8 %; free β-hCG 1,9 – 19,3 %.

K dispozici je také souprava DELFIA pouze pro free β-hCG.

AlphaLISA je postup, kdy se do mikrotitrační destičky pipetuje vzorek, pak se přidá akceptorová kulička potažena protilátkou vůči free β-hCG a druhá volná protilátka vůči free β-hCG s biotinylovou kotvou. Proběhne inkubace 15 min při 37 °C. Přidá se donorová kulička potažena streptavidinem a proběhne druhá inkubace 15 min při 37 °C ve tmě. Takto vznikne komplex, kde donorová kulička po ozáření 680 nm uvolní singletový kyslík, který vyvolá fluorescenci akceptorové kuličky 615 nm. Rozsah měření do 200 µg/l, analytická citlivost 0,11 µg/l. Preciznost v sérii 1,3 – 2,5 %, mezi sériemi 3,4 – 5,5 %; linearita ředění 98 – 108 %.

Chemiluminiscenční analýza je založena na sekvenční imunochemické reakci, kde je ALP jako marker. Free β-hCG se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váže jedním epitopem na monoklonální myší protilátku imobilizovanou na polystyrenové kuličce. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí reaguje druhý epitop free β-hCG s polyklonální kozí protilátkou konjugovanou s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se ihned rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření je přímo úměrná koncentraci free β-hCG ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Rozsah metody je 2 – 200 µg/l. Vzorky s koncentrací free β-hCG vyšší než 200 µg/l se ředí diluentem manuálně. Analytická citlivost 1 µg/l (2 SD), funkční citlivost: 2 µg/l (CV ≤ 20 %). Preciznost v sérii 2,5 – 6,1 %, celková 6,5 – 11,3 %. Zpětný výtěžek:  97 - 113 %, linearita ředění 88 – 102 %. Efekt nadbytku antigenu se do 133 735 µg/l neprojevuje. Hemolýza může rušit stanovení. Hemoglobin do koncentrace 6,0 g/l, bilirubin do koncentrace 342µmol/l a triacylglyceroly do 33,9 mmol/l neinterferují.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA)v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (10 µl) je inkubován s biotinylovanou monoklonální myší protilátkou vůči free β-hCG a monoklonální myší protilátkou vůči free β-hCG značenou ruthéniovým komplexem za vzniku sendvičové formace. Pak se přidají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem a celý komplex je vázán na pevnou fázi pomocí biotin-streptavidinové kotvy. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Luminiscence je přímo úměrná koncentraci free β-hCG ve vzorku. Chylozita, hemolýza, ikterus a RF (< 1000 kIU/l) neruší. Od pacientů léčených vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměly odebírat vzorky dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Metoda je použitelná v rozsahu 0,1 – 190 µg/l (ředění 10x automaticky, pak lze měřit koncentrace do 1900 µg/l, ale skutečná koncentrace po ředění musí být > 19 µg/l. Analytická senzitivita je 0,1 µg/l, funkční senzitivita 0,5 µg/l. Preciznost v sérii CV 1,0 – 2,6 %, mezi sériemi 1,2 – 2,9 %. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 800 µg/l.

Mezinárodní standard  1st IRP WHO 75/551.

Toleranční limit EHK: 20 %.

Hodnoty snižuje: kouření (pokles až o 21 % oproti nekuřačkám v 1. trimestru).

Hodnoty zvyšuje: transport v teple, těhotenství (zvláště vícečetné).

Heterofilní protilátky mohou interferovat u všech imunochemických metod.