1-methylhydantoin-2-imid, 1-methylglykocyamidin,
2-amino-1-methyl-4-imidazolidinon, 2-imino-1-methylimidazolidin-4-on

2-amino-1,5-dihydro-1-methyl-4H-imidazol-4-on

Stanovení se provádí v séru, plazmě a moči. Koncentrace kreatininu v séru a plazmě (antikoagulanty heparin nebo EDTA) je stejná. Pro enzymové metody, kde vzniká amoniak nelze použít jako antikoagulans heparinát amonný. Kreatinin je stabilní při opakovaném zamrazení a rozmrazení séra. Před vyšetřením není vhodná dieta s vyšším obsahem mastných bílkovin (maso, vývary) nebo větší fyzická zátěž. Hodnoty jsou ovlivněny věkem, svalovou hmotou a pohlavím.
Moč je sbíraná do plastových lahví (polystyrén) bez konzervačních látek a po dobu sběru se doporučuje skladovat odběrové nádoby v lednici. Před odlitím vzorku je nutno střádanou moč řádně promíchat, změřit objem s přesností na 10 ml (u velmi malých dětí s přesností na 1 ml); uvést přesně dobu sběru. Důležitý je kvantitativní sběr moči. Některé léky (salicyláty, cimetidin, trimethoprim) interferují s tubulární exkrecí kreatininu a ovlivňují tak hodnoty jeho clearence.

Kreatinin je stabilní 24 h za laboratorní teploty nad krevní sraženinou. Maximální doporučený čas od získání do zpracování vzorku je 4 h při doporučené teplotě 20°C. Stabilita: 18 - 26 °C sérum nebo plazma: 3 dny, moč
2 dny; 4 – 8 °C sérum nebo plazma: alespoň 7 dní moč 4 – 6 dní; -20 °C 1 rok sérum, plazma a moč půl roku.

Ke stanovení kreatininu se používají metody s alkalickým pikrátem, plně či částečně enzymové metody, HPLC metody a ID + MS.

Jaffeho metoda z roku 1886 se dosud běžně používá v rutinních laboratořích. Interferující látky, zvláště bílkoviny při jejím použití mohou falešně zvýšit výsledky až o 15 -25 %. Interference glukózy a acetoacetátu je zvláště významná, protože diabetici jsou skupinou s vysokým rizikem vzniku chronických nefropatií.
Reakci ovlivňují: koncentrace reaktantů, pH, vlnová délka měření, teplota, časový interval měření a interferující látky. Při reakci kreatinin s kyselinou pikrovou v alkalickém prostředí tvoří Janovského komplex při běžných koncentracích kreatinin-pikrát 1:1, při vysokých koncentracích analytu kreatinin-pikrát 2:1. Reakce je pseudoprvního řádu do 30 mmol/l a při koncentracích nad 6 mmol/l má nelineární počáteční rychlost. Vyšší pH vede k rychlejší reakci a současně k rychlejšímu rozkladu Janovského komplexu, takže roste absorbance blanku. Janovského komplex je málo citlivý na snížení pH. Maximální zbarvení reakčního produktu se dosahuje při pH 12,5. Použití pufrů vyvolává chelataci interferentů. Fosfátové pufry (136 až 173 mmol/l) zajišťují pH 9,65 až 11,50. Použití blanku je užitečné pro eliminaci většiny interferencí. Absorbance se měří při < 515 nm. Maximum absorbance je při 490 – 520 nm, přičemž při 510 – 520 nm je snížená absorbance blanku. Vyšší koncentrace hydroxidu vede bathochromnímu posunu. Detekce při 235 nm je také možná, ale nemá žádné přednosti. Zvýšení teploty vede ke vzrůstu absorbance Janovského komplexu a blanku. Reakční rychlost je vyšší o 30 – 60 % / 10 °C. Vyšší teplotní stabilita blanku je při > 510 nm. Nižší vlnové délky jsou citlivější na termochromní odezvu a mají tedy vyšší hodnotu blanku. Počátek měření má být alespoň 10 s od startu reakce, konec přibližně po 80 s, ačkoliv některé postupy počítají s měřením až do 120 s. Kinetické měření má trvat alespoň 20 s, ale kinetický režim kvalitu analýzy významně nezlepší, např. interference bilirubinu zůstává.
Při Jaffeho reakci interferují: bílkoviny, ketony, ketokyseliny, glukóza, bilirubin, některé léky, mastné kyseliny, vitamin C a další látky. Bílkoviny neruší do 90 s od startu reakce a 120 s od startu způsobuje 70 g/l albuminu interferenci +5 až 10 µmol/l kreatininu. Laurylsíran sodný snižuje interferenci bílkovin. Aceton vyvolává interference od 8 mmol/l v séru, ale mezi 10.-109. s neruší do 10 mmol/l v séru. Je-li aceton v moči do
5 mmol/l, pak při koncentraci kreatininu 1 mmol/l je chyba +97 %, ale při koncentraci kreatininu 8 mmol/l jen
+0,4 %. Acetoacetát interferuje od 0,25 mmol/l. Interference do 60 s: 1 mmol/l acetoacetátu odpovídá 10 µmol/l kreatininu, 8 mmol/l acetoacetátu 100 – 310 µmol/l kreatininu. Interference se už neprojeví mezi 60. až 120. s. Glukóza do 50. s neruší ani v koncentraci 85 mmol/l, mezi 60. – 120. s 50 mmol/l glukózy odpovídá negativní interferenci -8 µmol/l kreatininu. Koncentrace bilirubinu 250 µmol/l odpovídá -44 µmol/l kreatininu a interferenci lze odstranit přídavkem ferokyanidu draselného. Z léků nejvíce ruší cefalosporiny (10 mmol/l odpovídá
+500 µmol/l kreatininu), ale také: fenacemid, sulfonylmočovina, acetohexamid. Mastné kyseliny v koncentraci
0,4 mmol/l odpovídají +300 µmol/l kreatininu. Kyselina askorbová dává falešně nízké výsledky, protože částečně redukuje pikrát na pikramát.
Standardizovaný postup Jaffeho metody je E.P. bez deproteinace, s inkubací 20 min, poměrem sérum – činidlo 1:5 a koncentrací kyseliny pikrové 10,5 mmol/l.
Specifitu Jaffeho reakce může zvýšit fenolický derivát floridin, na který se adsorbuje kreatinin po deproteinaci vzorku. Podobné vlastnosti má Lloydovo činidlo (křemičitan hlinitý) nebo bentonit (čedičová hornina). Všechny tyto látky jsou porézní hlíny s velkou adsorptivitou (za 1 min adsorbují 92 % kreatininu). Po centrifugaci
a dekantaci lze přidat alkalický pikrát přímo k peletám adsorbentu. Při tomto postupu ruší pouze pyruvát
v přebytku 0,9 mmol/l a 2-oxoglutarát v přebytku 0,5 mmol/l. Podobnou purifikaci lze provést na sodné katexové pryskyřici v kyselém prostředí.
Intralaboratorní CV při koncentraci 88,4 µmol/l je
v intervalu 1,8 až 7,5 µmol/l. Vychýlení proti GC-IDMS je v intervalu -5,3 až +27 µmol/l. Interferující látky při Jaffeho metodě způsobují zvýšení výsledků o 20 % v plazmě
a séru, resp. +5 % v moči.

Další fotometrické metody využívají reakce s 1,4-naftochinon-2-sulfonátem nebo o-nitrobenzaldehydem. Mez detekce je 18 µmol/l.

Enzymové metody stanovení kreatininu mají obecně nižší interference než Jaffeho metody, ale i zde byly popsány interference zejména vlivem: bilirubinu, hemoglobinu, monoklonálního IgM a některých léčiv.
Hlavní enzymová metoda začíná přeměnou kreatininu na kreatin katalyzovanou kreatinin amidohydrolázou. Následně se kreatin fosforyluje ATP za katalýzy kreatinkinázou na kreatinfosfát. Vzniklý ADP reaguje se zpětně fosforyluje fosfoenolpyruvátem za katalýzy pyruvátkinázou. V detekčním kroku se pyruvát v oxidoredukční reakci redukuje na laktát a současně se oxiduje NADH na NAD⁺ za katalýzy laktát dehydrogenázou. Reprodukovatelnost v sérii je CV 2,3 – 5,6 %, mezi dny 5,7 – 7,8 %. Ve srovnání s uvedenou enzymovou reakcí poskytuje Jaffeho postup výsledky při koncentraci kreatininu 22 – 88 µmol/l + 20 až 50 % a při koncentraci kreatininu 89 – 177 µmol/l + 10 až 30 %.
Další enzymová metoda má identický první stupeň jako hlavní enzymová metoda. Následně se kreatin rozkládá kreatinázou na močovinu a sarkosin, který se oxidačně demetyluje na glycin, formaldehyd a peroxid vodíku.
K detekci slouží Trinderova reakce peroxidu vodíku se 4-aminoantipyrinem a fenolem, katalyzovaná peroxidázou. Mezidenní reprodukovatelnost byla 6,1 %, výtěžnost 96,1 %. V hemolytických sérech jsou výsledky o 4 – 10 % vyšší. Metoda není vhodná pro lipemická a ikterická séra. Jinou alternativou koncové reakce je využití formaldehydu, kdy se oxiduje pomocí NAD⁺ v přítomnosti formaldehyd dehydrogenázy na kyselinu mravenčí
a sleduje se při 340 nm nárůst redukovaného NADH.
Třetí postup začíná hydrolýzou kreatininu kreatinin iminohydrolázou na N-metylhydantoin a uvolněný amoniak (lze ho detekovat také amonnou elektrodou) reaguje v oxidoredukční reakci s kyselinou 2-oxoglutarovou na kyselinu glutamovou a současně se oxiduje NADPH na NADP⁺. Reprodukovatelnost mezi dny CV 3,4 – 10,0 %

Při reflexní fotometrii se využívá reakce kreatininu s kyselinou 3,5-dinitrobenzoovou, kdy vzniká purpurově-červený komplex (fotometrie při 560 nm). Tento postup umožňuje detekci již po 30 s při 560 nm s precizností 11,3 % při koncentraci 100 µmol/l.
Druhý postup začíná výše uvedenou enzymovou reakcí: tj. hydrolýzou kreatininu kreatinin iminohydrolázou na
N-metylhydantoin a uvolněný amoniak, které pak reaguje s bromfenolovou modří a reakce se sleduje při 600 nebo 670 nm. Při reakci interferuje sérový amoniak, který je nutno stanovit paralelní reakcí bez kreatinin imidohydrolázy.

K dispozici je více než 50 postupů stanovení HPLC kationově-výměnné chromatografie a chromatografie na normální nebo reverzní fázi. Přestože deproteinace představuje zvýšení specifity, jsou popsány i techniky bez deproteinace. HPLC je nejlepší z běžně dostupných metod ke stanovení kreatininu a specifitou předčí
i enzymové metody. Separace se provádí na katexu jako stacionární fázi s citrátovým pufrem (pH 4,25) jako mobilní fází.
Jiný postup používá kolonu s reversní fází a mobilní fází je pufr fosfát–laurylsíran sodný–metanol (pH 5,1). Detekce se provádí po Jaffeho reakci, nebo se detekuje přímo kreatinin při 200 nm. Oba postupy jsou rychlé, specifické a mají vysokou preciznost.

Jako referenční postupy jsou uvedeny tři GC-IDMS metody. Všechny vyžadují derivatizaci kreatininu (vzhledem
k jeho polaritě) a následné odstranění kreatinu (separace na katexu); jsou časově náročné. GC-IDMS má vynikající specifitu a SD < 0,3 %.
LC-IDMS metoda (rok 2003) je jednodušší a rychlejší (nevyžaduje derivatizaci, ale deproteinace zůstává); nebyla uznána jako referenční (ačkoliv vychýlení < 0,2 %), přestože se používá paralelně s referenčními metodami.

Doporučené rutinní metody stanovení: enzymové metody, HPLC, Jaffeho metoda bez deproteinace. Pro pacienty na hemodialýze a v transplantačních programech se doporučuje používat enzymovou metodu. Nedoporučené metody: Jaffeho metoda s deproteinací.

Standardní referenční materiál NIST 914a je krystalický kreatinin a používá se pro kalibraci GC-IDMS
a LC-IDMS.
Standardy NIST 909b-1, 909b-2, BCR: 573, 574, 575 jsou lyofilizovaná lidská séra různých koncentrací
s certifikovanou koncentrací kreatininu metodou GC-IDMS. Při lyofilizaci je změněna jejich matrice a nejsou tedy komutabilní s nativními séry při použití rutinních analytických metod.
SRM 967 jsou čerstvá zmrazená séra podle směrnice C-37A Clinical and Laboratory Standards Institute. Referenční materiály byly připraveny spoluprací několika institucí v roce 1999 a mají akceptovatelnou komutabilitu koncentrace 71 µmol/l a 354 µmol/l kreatininu mezi GC-IDMS a LC-IDMS a řadou rutinních metod.

Zpráva College of American Pathologists z roku 2001 uvádí preciznost CV 2,5% až 6,0% při koncentraci
177 µmol/l. Akceptovatelná kritéria kvality laboratoře (CLIA-88) pro kreatinin jsou ±26,5 µmol/l nebo ±15% (podle toho, co je vyšší). Intraindividuální variace sérového kreatininu u zdravých dospělých je 4 – 6 %. Z toho odvozená hodnota pro preciznost je 2,2 % a celková chyba stanovení ≤ 6,9 %.
Toleranční limit EHK: 15 % (sérum, plazma), 24 % (moč); CV pro vnitřní kontrolu kvality: 5 %.
Teoretický toleranční limit: 7,9 %.

Koncentraci kreatininu v plazmě a séru snižují: acetoacetát, bakteriální kontaminace (zpomalení Jaffeho reakce), bilirubin, citrát, dopamin (enzymové metody), EDTA, etanol, fluorid, hemodialýza, hemoglobin, IGF 1, intralipid, kreatin, oxalát, sarkosin, těhotenství (zejména 1. a 2. trimestr), triacylglyceroly > 28 mmol/l, vegetariánská dieta, žlučové soli, aj.
Koncentraci kreatininu v plazmě a séru zvyšují: acetoacetát, aceton, amikacin, amikin, aminohippurát, arginin, bílkoviny, cefalosporiny, cimetidin, cvičení, cyklosporin, dehydratace, dopamin (Jaffeho metody), erytropoetin,
5-flucytosin, fluoridy, 5-fluorocytosin, framykoin, fruktóza, gentamycin, glukóza, glutamin, guanidin, hladovění, hydantoin, hydroxybutyrát > 1 mmol /l, interleukin-2, kyselina acetoctová, kyselina močová, laktulóza, levulóza, manit, metyldopa, oxalacetát, pyruvát, růstový hormon, vitamin C, proteinová dieta, těhotenství (4. – 9. měsíc), trimecrytron, trimethoprim, tymol, urandil, aj.

Koncentraci kreatininu v moči snižují: běloba, čokoláda, detergenty, etanol, fosforečnan draselný, fluorescein, kofein, malnutrice, vegetariánská dieta, aj.
Koncentraci kreatininu v moči zvyšují: aceton, asparagin, cvičení, etanol, histidin, indol, kyselina hippurová, kyselina homogentisová, kyselina pyrohroznová, spasmoveralgin, superanabolon, těhotenství (od 4. týdne), aj.