Popis vyšetření: CHROMOGRANIN A

Zařezeno v kategoriích:

Synonyma:

CGA, CgA, SP-1 (stejnou zkratku má specifický těhotenský beta1-glykoprotein), paratyreoidální  sekreční protein 1; hypofyzární sekreční protein I

Preanalytická fáze:

Stanovení se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans EDTA nebo heparin). Odběr se provádí ráno nalačno. Plná krev je stabilní při laboratorní teplotě 12 h, plazma při 2 – 8 °C 7 d, při -20 °C 6 – 12 měsíců.

Poznámky k analytické metodě:

RIA Uplatňuje se kompetitivní postup, kdy vzorky a kalibrátory jsou inkubovány ve zkumavkách 20 – 24 h při 2 – 8 °C s 125I-chromograninem A, a s králičím antisérem proti lidskému  chromograninu A. Pak se přidají celulózové částice potažené králičím IgG, na které je králičí antisérum fixováno. Po inkubaci 30 – 60 min při 2 – 8 °C se obsah zkumavek centrifuguje při 4 °C a 1700 g. Obsah zkumavek se dekantuje a radioaktivita částic se měří gama-počítačem (1 – 3 min). Signál je nepřímo úměrný koncentraci chromograninu A ve vzorku. Rozsah měření na základě sedmibodové kalibrace 0 – 5 nmol/l. Vzorky > 5 nmol/l se ředí 10x diluentem a výsledky se násobí dilučním faktorem. Koncentrace > 50 nmol/l se mohou ředit ještě více. Analytická citlivost je 0,15 nmol/l. Preciznost v sérii je 7,4 – 8,2 % mezi sériemi 5,5 – 6,4 %. Pozn. uvádět výsledky v nmol/l není zcela korektní, protože molekulová hmotnost chromograninu A kolísá mezi 48000 – 60000 podle stupně glykosylace a fosforylace.

ELISA v sendvičovém uspořádání probíhá v mikrotitrační destičce se zakotvenou polyklonální králičí protilátkou vůči chromograninu A. Do jamky se přidá standard nebo vzorek a polyklonální králičí protilátka vůči lidskému chromograninu A s navázanou křenovou peroxidázou a inkubuje se 150 min (nebo ve dvou krocích 120+60 min s promytím mezi kroky 5x).  Po inkubaci následuje promytí (5x), přidá se chromogen tetrametylbenzidin a reakce probíhající 20 min je zastavena stop činidlem (0,5 M H2SO4). Měření se provádí do 10 min při 450/650 (595-630) nm. Celý postup se realizuje za laboratorní teploty. Rozsah měření na základě pěti – šestibodové kalibrace je 5 – 450 U/l (0 – 500 µg/l; vyšší koncentrace se ředí 100x, případně 10000x) a signál je přímo úměrný koncentraci chromograninu A. Detekční limit je 2 U/l (5 µg/l). Preciznost v sérii je 3,6 – 4,2 %, mezi sériemi 5,6 – 6,7 %. Linearita ředění 94 – 108 %, zpětný výtěžek 89 – 101 %. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 1000000 µg/l.

Chemiluminiscenční analýza - stanovení je založeno na nekompetitivní (sendvičové) imunochemické reakci s detekcí záblesku vzniklého chemiluminiscenční reakcí. Chromogranin A se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váže jedním epitopem na purifikovanou polyklonální králičí protilátku vůči chromogranininu A, která je zakotvená na stěně zkumavky (2 h za laboratorní teploty). Neobsazená místa protilátky jsou saturována fosfátovým pufrem. Následně se přidává monoklonální myší protilátka značená esterem akridinu (2 h za laboratorní teploty). Po odstranění nezreagovaného materiálu odsátím a promytím se přidá alkalizovaný peroxid vodíku, který vyvolá chemiluminiscenční záblesk detekovaný luminometrem. Intenzita záření je přímo úměrná koncentraci chromograninu A ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky na základě sedmibodové kalibrace. Rozsah metody je 1 – 1000 µg/l. Detekční limit metody je 1 µg/l. Preciznost v sérii je 3,3 – 5,5 %, mezi sériemi 2,9 – 12,6 %; zpětný výtěžek: 78 – 122 %.

Významné interference:

Hodnoty snižuje: somatostatin, oktreotid, glutation.

Hodnoty zvyšuje: přítomnost vysokých koncentrací revmatoidního faktoru IgM, cvičení, hemodialýza.