Coxsackie A virus antibodies

Odběr venosní srážlivé krve se provádí ráno nalačno. Následná odběr nejdříve po 14 dnech. Stabilita séra při laboratorní teplotě alespoň 1 d, při 4 – 8 °C 7 d, při -20 °C 1 rok.

Fixace komplementu je semikvantitativní test, při kterém řada malých bílkovin reaguje s komplexem antigenu Coxsackie A. Napřed se tepelně denaturuje komplement séra a přidá se standardní množství morčecího komplementu. Dále se přidá Coxsackie A. Pokud nejsou přítomné protilátky vůči tomuto viru, dochází k lýze přidaných ovčích erytrocytů komplementem a vzniká růžové zbarvení. Pokud jsou protilátky přítomné, vytvoří imunokomplex s virem Coxsackie A, který vyváže komplement a vzniká sraženina. Proto nedochází k lýze ovčích erytrocytů (volný komplement není v dispozici). 

ELISA IgG (Coxsackie A virus) v sendvičovém uspořádání se provádí v mikrotitračních destičkách se zakotveným antigenem Coxsackie A. Kalibrátory nebo ředěné vzorky se pipetují do jamek, pak se roztoky 60 min inkubují při 37 °C. Obsah jamek se vyprázdní a jamky se 4x promyjí fyziologickým roztokem s emulgátorem Tween 20. Přidá se kozí protilátka vůči lidskému IgG značená ALP, roztok se inkubuje 30 min při 37 °C a opět se obsah jamek 4x promyje fyziologickým roztokem s emulgátorem Tween 20; přidá se substrát p-nitrofenylfosfát a následuje další inkubace 30 min při 37 °C. Další krok je přidání stop činidla (1,2 M NaOH) a následuje měření při 405 nm (proti 620 – 690 nm), které nutno provést do 60 min. Signál je přímo úměrný množství stanovované protilátky. Jednobodová kalibrace (dubletu) je nastavena pomocí firemní čtyřparametrové logistik-log křivky. Výsledky se uvádí v kU/l. Variace při měření vertikální absorbance (optické hustoty) < 20 %.

ELISA IgA (Coxsackie A virus) v sendvičovém uspořádání se provádí v mikrotitračních destičkách se zakotveným antigenem Coxsackie A. Kalibrátory nebo ředěné vzorky se pipetují do jamek, pak se roztoky 60 min inkubují při 37 °C. Obsah jamek se vyprázdní a jamky se 4x promyjí fyziologickým roztokem s emulgátorem Tween 20. Přidá se kozí protilátka vůči lidskému IgA značená ALP, roztok se inkubuje 30 min při 37 °C a opět se obsah jamek 4x promyje fyziologickým roztokem s emulgátorem Tween 20; přidá se substrát p-nitrofenylfosfát a následuje další inkubace 30 min při 37 °C. Další krok je přidání stop činidla (1,2 M NaOH) a následuje měření při 405 nm (proti 620 – 690 nm), které nutno provést do 60 min. Signál je přímo úměrný množství stanovované protilátky. Jednobodová kalibrace (dubletu) je nastavena pomocí firemní čtyřparametrové logistik-log křivky. Výsledky se uvádí v kU/l. Variace při měření vertikální absorbance (optické hustoty) < 20 %.

ELISA IgM (Coxsackie A virus) v sendvičovém uspořádání se provádí v mikrotitračních destičkách se zakotveným antigenem Coxsackie A. Kalibrátory nebo ředěné vzorky se pipetují do jamek, pak se roztoky 60 min inkubují při 37 °C. Obsah jamek se vyprázdní a jamky se 4x promyjí fyziologickým roztokem s emulgátorem Tween 20. Přidá se kozí protilátka vůči lidskému IgM značená ALP, roztok se inkubuje 30 min při 37 °C a opět se obsah jamek 4x promyje fyziologickým roztokem s emulgátorem Tween 20; přidá se substrát p-nitrofenylfosfát a následuje další inkubace 30 min při 37 °C. Další krok je přidání stop činidla (1,2 M NaOH) a následuje měření při 405 nm (proti 620 – 690 nm), které nutno provést do 60 min. Signál je přímo úměrný množství stanovované protilátky. Jednobodová kalibrace (dubletu) je nastavena pomocí firemní čtyřparametrové logistik-log křivky. Výsledky se uvádí v kU/l. Variace při měření vertikální absorbance (optické hustoty) < 20 %.

Používá se také fluorescenční mikroskopie. Buňky s Coxsackie A virem se inkubují s protilátkami třídy IgG, IgA a IgM ze vzorku. Imunokomplex je pak vybarven kozími protilátkami vůči příslušné třídě lidského imunoglobulinu s navázaným fluoresceinem a prohlížen ve fluorescenčním mikroskopu. Pro stanovení IgA a IgM je vhodné odstranit IgG protilátky ze séra imunoabsorpcí.

Zkřížená reakce s Legionella pneumophilia. Nespecifické IgM protilátky RF mohou způsobit falešně pozitivní výsledky IgM protilátek.