nádorový marker CA 15-3, CA 15-3 protein, CA15-3 protein, Cancer Antigen 15-3 protein, Breast Tumor protein, Carbohydrate Antigen CA 15-3, Carbohydrate antigen 15.3, ANTIGEN CA 015 003, Antigen CA 15 3, Antigen CA 15.3, Antigen CA 15-3, Antigen CA-15-3, CA 15 3 Antigen, CA 15.3 Antigen, CA 15.3 Carbohydrate antigen 15.3, CA 15-3 Antigen, CA, Ca15-3, Cancer Ag 15-3, Cancer Antigen 15-3, DF3 Antigen, Episialin, Antigen Epithelial Membrane, Epithelial membrane antigen, Epithelial Mucin Polymorphic, MUC1, Glycosylated MUC-1, ImMucin, MUC MUCIN 001, MUC-1 antigen, Muc1 Mucin, Mucin Muc1, Mucin Peptide, Mucin Peptide MUC-1, Polymorphic Epithelial Mucin.

Stanovení se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans heparinát lithný nebo EDTA). Ruší hemolýza a chylozita. Opakované zamrazení se nedoporučuje. Stabilita vzorku: 8 h při 20 – 25 °C, 1 – 14 d při 4 – 8 °C, 3 – 12 měsíců při -20 °C.

IRMA je dvoukrokový sendvičový postup, který začíná pipetováním séra do zkumavek potažených streptavidinem a pak následuje přidání monoklonální protilátky 115D8 a inkubace 1 h (třepání). Po inkubaci se supernatant odsaje a zkumavky se 3x promyjí. Pak se přidá druhá monoklonální protilátka DF3 značená ¹²⁵I. Po inkubaci (1 h, třepání) se supernatant odsaje a zkumavky se 3x promyjí. Navázaná aktivita se změří gama-počítačem (1 min). Celý postup se provádí za laboratorní teploty. Rozsah metody na základě šestibodové kalibrace je 1,35 – 300 kU/l; analytická citlivost 0,24 kU/l, funkční citlivost 1,35 kU/l. Preciznost v sérii je 1,33 – 1,84 %, mezi sériemi 3,12 – 4,66 %; zpětný výtěžek 104 – 108 %, linearita ředění 83,9 – 92,1 %. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 7500 kU/l. 

Jiná IRMA používá zkumavky potažené monoklonální protilátkou 115D8. Pak je postup jednokrokový (přidává se ředěný vzorek a MAb ¹²⁵I-DF3) s inkubací 2 h (třepání). Po inkubaci se supernatant odsaje a zkumavky se 3x promyjí. Navázaná aktivita se změří gama-počítačem (1 min). Celý postup se provádí za laboratorní teploty. Rozsah metody na základě šestibodové kalibrace je 2 – 300 kU/l; analytická citlivost 2 kU/l. Preciznost v sérii je 2,8 – 2,9 %, mezi sériemi 4,2 – 4,9 %; zpětný výtěžek 97 – 104 %, linearita ředění 94 – 101 %. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 12300 kU/l.   

ELISA používá mikrotitrační destičky se zakotvenou myší monoklonální protilátkou vůči CA 15-3 (některé testy používají destičku potaženou streptavidinem a biotinylovaná Ab se zakotví až během testu). Pipetuje se kalibrátor nebo vzorek a po inkubaci (30 min) se roztok odsaje a jamky 5x promyjí. Pak se přidá druhá (králičí) protilátka proti CA 15-3 označená křenovou peroxidázou (některé testy používají myší monoklonální protilátku s POD, také lze pipetovat vzorek a druhou protilátku za sebou a sendvič vytvořit v jediné delší inkubaci). Imunoreakce se provádí se 30 min, roztok se odsaje a jamky 5x promyjí. Dále se přidává tetrametylbenzidin (inkubace 20 min ve tmě) a následně stop činidlo (1 M HCl, případně 1 M H₂SO₄). Měření se provádí při 450 nm do 15 min na základě šestibodové kalibrace v rozmezí 1 – 200 kU/l (některé testy do 240 kU/l). Celý postup se provádí za laboratorní teploty. Preciznost v sérii 3,8 – 5,5 %, mezi sériemi 5,2 – 7,9 %. Zpětný výtěžek 85,8 – 114,1 %, linearita ředění 95,2 – 113,8 %. Hemolýza, lipémie a ikterus neruší. Analytická citlivost je 0,905 kU/l. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 3000 kU/l.

Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) probíhá tak, že se do reakční nádobky dávkuje vzorek ředěný TRIS pufrem a poté latexové mikročástice potažené myší monoklonální protilátkou vůči 115D8. Po inkubaci se reakční směs přenese na fritu a nenavázaný materiál se oddělí promytím. Přidá se myší monoklonální protilátka vůči DF3 značená ALP v pufru TRIS. Po inkubaci a promytí se dávkuje substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí na fluoreskující umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky. Šestibodová kalibrace je v rozsahu 0,3 – 250 kU/l. (Vzorky s hodnotami CA 15-3 > 250 kU/l lze automaticky nebo manuálně ředit; při automatickém ředění systém vzorek naředí 10x – hodnota po ředění musí být > 15 kU/l a po vynásobení do 2500 kU/l). Preciznost v sérii je 2,8 – 6,1 %, celková preciznost metody je 3,8 – 8,6 %; zpětný výtěžek 93 – 108 %. Analytická senzitivita je 0,3 kU/l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší, přestože v preanalytické části se nedoporučují.

Zesílená fluorescence rozložená v čase je označována jako TRACE (time resolved amplified cryptate emission), kdy se měří fluorescenční signál se zpožděním v homogenním prostředí. Donor (MAb-Eu³⁺ v micele) po ozáření dusíkovým laserem 337 nm emituje světlo 620 nm s dlouhou životností (ms), akceptor (MAb-sběrný protein) generuje signál 665 nm s krátkou životností (ns). Jestliže jsou obě složky v imunokomplexu, pak dochází v imunokomplexu k zesílení signálu a prodloužení jeho životnosti. Sendvičová reakce probíhá 14 min mezi CA 15-3 ze vzorku, monoklonální protilátkou vůči CA 15-3 značenou Eu³⁺ a monoklonální protilátkou vůči CA 15-3, která je připojena na sběrný protein. Měřený signál je po sendvičové imunoreakci (připojení obou značených monoklonálních protilátek k CA 15-3) přímo úměrný hladině CA 15-3. Na základě jednobodové kalibrace je rozsah měření 0,3 – 500 kU/l (po automatickém ředění až do 40000 kU/l). Analytická citlivost je 0,3 kU/l, funkční citlivost 1,0 kU/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 40000 kU/l. Preciznost v sérii 0,4 – 2,2 %, mezi sériemi 2,1 – 7,0 %. Hemoglobin neruší do 5 g/l, triacylglyceroly do 9 mmol/l, bilirubin nevadí. Linearita ředění je 90 – 110 %.

Chemiluminiscenční analýza v sendvičovém uspořádání používá monoklonální myší protilátku vůči 115D8 zakotvenou na paramagnetických částicích, ke které se přidává ředěný standard nebo vzorek. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá myší monoklonální protilátka vůči DF3 značená akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je přímo úměrná hladině CA 15-3 a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Metoda dovoluje měřit vzorky na základě šestibodové kalibrace v rozmezí hodnot 1 – 800 kU/l (Vzorky s hodnotami CA 15-3 > 800 kU/l lze automaticky nebo manuálně ředit; při automatickém ředění systém vzorek naředí 5x, po ředění musí být hodnota > 30 kU/l). Preciznost v sérii je 1,7 – 4,7 %, celkově 2,2 – 5,1 %; zpětný výtěžek 84 – 97 %, linearita ředění 80 – 101 %. Analytická senzitivita (2 SD nulového kalibrátoru) ≤ 0,5 kU /l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 22000 kU/l.

Podobný princip zábleskové luminiscence lze použít s esterem akridinu jako značkou. Ke vzorku pacientského séra se přidá monoklonální myší protilátka vůči 115D8 značená fluoresceinem ve fosfátovém pufru hovězího sérového albuminu a monoklonální myší protilátka vůči fluoresceinu, která je vázaná kovalentně na paramagnetické částice ve fosfátovém pufru hovězího sérového albuminu. Inkubuje se 4,66 min při 37°C. Po odsátí roztoku a promytí zkumavek se přidá monoklonální myší protilátka vůči DF3 značená esterem akridinu a inkubuje se 21,66 min při 37 °C.  Po odsátí roztoku a promytí zkumavek se přidá peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk fotonásobičem při 429 nm na základě šestibodové kalibrace. Vzorky s hladinou CA 15-3 > 200 kU/l se ředí 5x, 10x nebo 20x automaticky nebo manuálně. Vzorky > 4000 kU/l CA 15-3 se ředí pouze manuálně. Analytická citlivost je 0,5 kU/l. Preciznost v sérii 4,4 – 5,1 %, mezi sériemi 3,6 – 5,4 %. Linearita ředění je 92,3 – 108,8 %, zpětný výtěžek 89,5 – 101,6 %. Analýzu neruší hemolýza, chylozita nebo ikterus, ačkoliv v preanalytické části se nedoporučuje zpracovávat takové vzorky.

CLIA je další dvojstupňový zábleskový postup, kdy na magnetické částice potažené myší monoklonální protilátkou 115D8 se naváže během první inkubace (10 min) CA 15-3 a po promytí se na jeho další epitop připojí během další inkubace (10 min) druhá monoklonální protilátka DF3 značená izoluminolem. Po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu přímo úměrná hladině CA 15-3. Rozsah měření je na základě dvoubodové kalibrace 0,5 – 1000 kU/l (při vyšších hodnotách lze sérum ředit diluentem dle potřeby). Analytická citlivost je 0,5 kU/l. Preciznost v sérii 1,8 – 3,1 %, mezi sériemi 3,6 – 7,6 %. Linearita ředění je 101 – 107 %, zpětný výtěžek 96 – 109 %. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 30720 kU/l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší.

Jiné stanovení je založeno na sendvičové imunochemické reakci se sledováním luminiscence zesílené enzymem. CA 15-3 se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váže na myší monoklonální protilátku vůči CA 15-3 imobilizovanou na polystyrénové kuličce. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytím se na druhé vazebné místo CA 15-3 naváže druhá monoklonální protilátka vůči CA 15-3 konjugovaná s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření 425 – 500 nm je přímo úměrná koncentraci CA 15-3 ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Rozsah kalibrace je do 300 kU/l, avšak do hodnoty 80000 kU/l nebyl pozorován efekt nadbytku protilátky. Analytická citlivost je 1 kU/l. Preciznost v sérii 5,5 – 8,1 %, celková 7,4 – 8,8 %; zpětný výtěžek 89 – 114 %, linearita ředění 95 – 105 %.

Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530. Do zkumavky se pipetuje standard nebo vzorek obsahující CA 15-3, paramagnetické částice potažené kozí protilátkou proti biotinu, monoklonální myší protilátka vůči CA 15-3 s biotinovou kotvou a druhá monoklonální myší protilátka vůči CA 15-3 značená ALP. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je přímo úměrné množství CA 15-3. Rozsah měření při 470 nm na základě šestibodové kalibrace je 0,5 – 1000 kU/l. (po ředění 10x až do 10000 kU/l). Efekt nadbytku protilátky nebyl prokázán do 30000 kU/l. Preciznost v sérii je 1,4 – 2,2 %, mezi sériemi 1,6 – 4,1 %. Linearita ředění je 84,9 – 115,9 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší. Senzitivita stanovení je 80,3 %, specificita 98,7 %.

Chemiluminiscenční analýza v sendvičovém provedení, kdy CA 15-3 ze vzorku se váže na biotinylovanou myší monoklonální protilátku vůči 115D8. Imunokomplex se naváže na jamky potažené streptavidinem. Po inkubaci se promytím odstraní volný materiál a přidá se myší monoklonální protilátka vůči DF3 značená křenovou peroxidázou. Po inkubaci se promytím odstraní volný materiál a přidá se luminogen (derivát luminolu + sůl peroxykyseliny) jehož oxidaci katalyzuje POD za vzniku světla. Činidlo pro přenos elektronů (substituovaný acetanilid) zvyšuje hladinu uvolněného světla a prodlužuje jeho emisi. Signál na základě dvoubodové kalibrace je přímo úměrný koncentraci CA 15-3 ve vzorku. Rozsah měření 0,7 – 500 kU/l (vyšší koncentrace CA 15-3 jsou automaticky ředěné 5x). Analytická senzitivita 0,3 kU/l, funkční senzitivita 0,7 kU/l. Preciznost v sérii 1,2 – 2,7 %, mezi sériemi je 1,8 – 6,6 %. Hladiny biotinu zůstávají v séru zvýšené 24 h po podání. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 47000 kU/l.

Homogenní chemiluminiscenční imunoanalýza v sendvičovém uspořádání je založena na technologii LOCI. Reagencie LOCI zahrnuji dvě syntetické reagencie na částicích a fragment monoklonální biotinylované protilátky vůči M11. První reagencie (Chemibeads) je potažena monoklonální protilátkou vůči 115D8 a obsahuje chemiluminiscenční barvivo. Druhá reagencie (Sensibeads) je pokryta streptavidinem a obsahuje fotosenzibilizační barvivo. Vzorek se inkubuje s biotinylovanou protilátkou DF3 a reagencii Chemibeads a vytvoří se sendvičové komplexy: částice–monoklonální protilátka–CA 15-3–biotinylovaná protilátka. Poté jsou přidány reagencie Sensibeads, navážou se na biotin a vytvoří párové imunokomplexy s oběma částicemi. Ozářením komplexů světlem vlnové délky 680 nm se z reagencii Sensibeads uvolni singletový kyslík, který se rozptýlí do reagencii Chemibeads a spustí chemiluminiscenční reakci. Výsledný signál je měřen při vlnové délce 612 nm a je přímo úměrný koncentraci CA 15-3 ve vzorku. Analýza trvá 16 min při 37 °C. Rozsah metody na základě pětibodové kalibrace je 1 – 300 kU/l (automatické ředění umožňuje zvětšit rozsah měření 10x, lze také ředit manuálně). Detekční limit je 1 kU/l. Preciznost v sérii 1,4 – 2,9 %, mezi sériemi 2,4 – 4,0 %. Zpětný výtěžek 96,3 – 105,1 %, linearita ředění 92 – 102 %. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 20000 kU/l. Hemolýza, chylozita ani ikterus neruší (navzdory doporučení).

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou(ECLIA) v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (20 µl) je inkubován s monoklonální myší protilátkou vůči DF3 značenou ruthéniovým komplexem a biotinylovanou monoklonální myší protilátkou vůči 115D8. Pak se přidají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem, na který se naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Luminiscence je přímo úměrná hladině CA 15-3 ve vzorku. Metoda je použitelná v rozsahu 1 – 300 kU/l. Ředění při vyšších koncentracích 10x, je-li hodnota po ředění > 30 kU/l. Analytická citlivost (2 SD nulového kalibrátoru) je 1 kU/l, funkční citlivost (CV ≤ 20 %) 1 kU/l. Preciznost v sérii < 3,4 %, mezi sériemi < 4,3 %. Hemolýza, chylozita, ikterus a RF (< 1500 kIU/l) neruší. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměli odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 20000 kU/l.

Toleranční limit EHK: 18 %.

Snížené hodnoty: efekt nadbytku antigenu.

Zvýšené hodnoty: někdy v těhotenství (8 % žen) a při laktaci (4 – 7 % žen), při hemodialýze, transplantaci ledvin.

Heterofilní protilátky působí nespecificky.