Popis vyšetření: GLUTATIONTRANSFERÁZA

Zařezeno v kategoriích:

Synonyma:

Systematický název: RX:glutathion R-transferasa, EC 2.5.1.18;
Ostatní názvy: GST; glutathiontransferasa; glutathion-S-transferasa; glutathion-S-alkyltransferasa; glutathion-S-aryltransferasa; glutathion-S-aralkyltransferasa; S-(hydroxyalkyl)glutathionlyasa.

Chemické názvosloví připouští u enzymů pouze koncovku –asa, progresivní pravopis a řada současných lékařských publikací uvádí koncovku –áza. V anglickém názvosloví EC je kmenový základ někdy (např. S-aralkyltransferase) spojený s názvem přenášené skupiny, jindy ale (např. transferase) může být samostatně. Glutathione je v anglickém názvosloví vždy samostatně, v české verzi je glutathion připojen ke kmenovému základu.

Preanalytická fáze:

Stanovení se provádí v séru nebo moči (střední prou druhé moče nebo sběr za 24 h). Stanovení lze také provádět v tkáňových lyzátech nebo kultivačních médiích. Odstřeďovat v chlazené centrifuze, vzorky dopravovat na ledu, pro pozdější zpracování skladovat plazmu při -80 °C (stabilita 1 měsíc).

Poznámky k analytické metodě:

Fotometrie: Glutationtransferáza katalyzuje reakci mezi glutationem a substrátem glutationtransferázy, tj. 1-chlor-2,4-dinitrobenzenem, který je schopen detekovat širokou škálu izoenzymů GST (např. α, µ, p a jiné). Za určitých podmínek je interakce mezi glutationem a substrátem úplně závislá na aktivitě GST. Takto vzniká dinitrofenyltioeter, který lze detekovat při 340 nm. Detekční limit je 0,07 µkat/l. Analýza trvá 1 – 1,5 h. Postup lze provádět i v mikrotitračních destičkách. V kinetické verzi trvá měření jen 5 min (rozsah měření 0,4 – 2,1 µkat/l; absorbance se měří v minutových intervalech). Preciznost v sérii < 3,6 %, mezi sériemi < 4,8 %. Hemolýza při analýze ruší. Rovněž vadí některé detergenty (např. polysorbát nebo CHAPS, tj. 3-[(3-cholamidopropyl)dimetylamonio]-1-propansulfonát) a proteázové inhibitory (např. antipapain, leupeptin, trypsin, chymostatin).

K dispozici je i souprava s fluorescenční detekcí (antrachinonové modře fluoreskující barvivo – monochlorbiman) pro vědecké účely s citlivostí 0,008 µkat/l.

ELISA (sendvičový princip) na mikrotitračních destičkách má jamky potažené protilátkou vůči GST. Vzorek nebo standard se během inkubace (2 h, třepání) váže na protilátku. Po trojnásobném promytí se přidá primární detekční protilátka a opět se inkubuje (1h, třepání). Po trojnásobném promytí se přidá druhá detekční protilátka, značená křenovou peroxidázou. Po inkubaci (1 h, třepání) a trojnásobném promytí se přidá tetrametylbenzidin a vzniklé modré zbarvení se měří ihned kineticky při 600 nm, nebo se provede okyselení 1 M HCl a vzniklé žluté zbarvení se měří při 450 nm. Signál je přímo úměrný koncentraci GST. Celý postup probíhá za laboratorní teploty. Detekční limit pro měření koncentrace enzymu je 1 µg/l. Sedmibodová kalibrace umožňuje měřit v rozsahu 9 – 400 µg/l. Preciznost v sérii 8,5 %, mezi sériemi 4 %.  Linearita ředění je 78,4 – 126 %. Zpětný výtěžek podle typu použitého pufru 63 – 94 %.

Postup lze také výrazně zkrátit. Vzorek a druhá biotinylovaná protilátka se přidávají hned za sebou. Po inkubaci (30 min, 37 °C) a čtyřnásobném promytí se přidá streptavidin konjugovaný s křenovou peroxidázou a inkubuje se 15 min při 37 °C. Přidá se tetrametylbenzidin a reakce se po 15 – 20 min zastaví stop činidlem. Detekční limit pro měření koncentrace enzymu je 1 µg/l. V tomto případě je rozsah měření 3,125 – 100 µg/l. Preciznost v sérii je 5 %, mezi sériemi 10 %; zpětný výtěžek 85 – 115 %.

Významné interference:

Vyšší hodnoty způsobuje halotan.