kokcidie kočičí - protilátky

Odebírá se venózní srážlivá krev nalačno. Je třeba vyloučit hemolýzu a chylozitu. Sérum je stabilní při laboratorní teplotě 4 h – 3 d, při 4 – 8 °C 2 – 21 d, při -20 °C 3 – 12 měsíců. Vyšetření lze provést i v plazmě nebo plodové vodě (ELISA, western blot).

Sabin-Feldfmanův barevný test je referenční sérologický test s mikroskopickou detekcí Toxoplasma gondii.Test je založený na tom, že specifické protilátky vůči tomuto prvoku brání metylenové modři vstoupit do jeho cytoplasmy. K séru pacienta se přidají trofozoity toxoplasmosy a komplement jako aktivátor. Provede se inkubace a po ní se přidá metylenová modř. Jestliže jsou přítomné protilátky vůči Toxoplasmě gondii, tak jsou aktivovány komplementem a lyzují membránu prvoka. Trofozoity toxoplasmy se nevybarví (pozitivní výsledek). Jestliže nejsou přítomné protilátky, membrána trofozoita zůstává neporušená, vybarví se, a zůstává modrá při mikroskopování (negativní výsledek).

Komplement fixační reakce V reakci je pět složek: antigen (Toxoplasma gondii), vyšetřované sérum pacienta, komplement, beraní krvinky, králičí sérum s protilátkami proti ovčím krvinkám (tzv. amboceptor). Princip reakce lze popsat ve 4 krocích: smísí se zkoumané sérum, v němž byl inaktivován vlastní komplement a příslušný antigen (pozitivita: vzniknou komplexy antigen-protilátka, negativita: komplexy antigen-protilátka nevzniknou) – inkubace při 4 °C 18 h; přidá se morčecí komplement alexin (pozitivita: komplement se vyváže na komplexy antigen-protilátka, negativita: komplement se nevyváže a je nadále aktivní) – inkubace při 37 °C 2 h; mimo reakci se připraví tzv. hemolytický systém, tj. ovčí krvinky s navázanými protilátkami proti těmto (zdrojem protilátek je obvykle králičí antisérum proti ovčím krvinkám); do reakce se přidá hemolytický systém (pozitivita: komplement je vyvázán, tedy neaktivní a nedojde k hemolýze, negativita: komplement se vyváže na hemolytický systém tj. vlastně komplexy antigen-protilátka a dojde k hemolýze. Reakce se hodnotí v několika ředěních séra. Jako výsledek se udává nejvyšší ředění séra (titr), při kterém ještě nedošlo k hemolýze. Reakce je citlivá, ale nelze rozlišit jednotlivé třídy protilátek.

Nepřímá hemaglutinace Principem reakce je aglutinace lidských erytrocytů senzitivizovaných  antigenem Toxoplasma gondii v přítomnosti protilátek vůči Toxoplasmě gondii. Pacientské sérum se ředí dvojkovou řadou TRIS pufrem s NaCl a králičím sérem. Vzorek ředěného séra se smísí se senzitivizovanými erytrocyty, protřepe na třepačce a inkubuje se 3 – 24 h min při 15 – 25 °C. Většinou se reakce hodnotí pouze kvalitativně a provádí se v několika ředěních séra. Jako výsledek se udává nejvyšší ředění séra dvojkovou řadou (tzv. titr) při kterém došlo k 50 % hemaglutinaci. Negativní výsledek je při titru < 1:64. Výsledky se mohou vydávat i v kU/l (arbitrární jednotky). Senzitivita testu je 100 %, specifita 97,3 %. Při testu se nerozlišují protilátky IgG a IgM.

ELISA IgG Specifické protilátky proti Toxoplasmě gondii obsažené v testovaném vzorku se po pipetování vážou na antigen v reakčních jamkách testovací destičky. Inkubace se provádí 60 min při 37 °C. Po promytí fosfátovým pufrem (4x) se přidá konjugát POD a fragmentu králičí protilátky F(ab)´ vůči lidskému IgG, který se váže na tyto specifické protilátky. Inkubace se provádí 60 min při 37 °C. Po promytí fosfátovým pufrem (4x) se přidá tetrametylbenzidin. Enzymatická část konjugátu způsobí modré zabarvení tetrametylbenzidinu. Reakce probíhá při 18 – 25 °C 30 min ve tmě. Tato reakce je zastavena přidáním zastavovacího roztoku, který způsobí žluté zabarvení. Sytost barvy je měřítkem imunochemické reaktivity specifických IgG protilátek proti Toxoplasmě gondii obsažených ve vzorku. Absorbance se měří do 60 min při 450/615-690 nm. Pro jednotlivé soupravy je uvedený korekční faktor k výpočtu cut-off. Kvantifikace v mezinárodních jednotkách se provádí výpočtem pomocí α-metody (pomocí firemních konstant lze uvádět v kU/l – ale opět jsou to víceméně arbitrární jednotky). Hemolytické, lipemické a ikterické vzorky neovlivňují výsledek testu. Preciznost v sérii 6,7 – 12,0 %, mezi sériemi 7,0 – 17,2 %. Senzitivita byla 100 %, specificita > 98,3 %.

ELISA IgM Test je založen na metodě µ-záchytu , což je metoda, která používá jako pevnou fázi namísto specifických antigenů specifické IgM protilátky proti µ‑řetězcům lidských protilátek. Po předběžném ošetření vzorků (15 min při 15 – 25 °C) ovčí protilátkou vůči lidskému IgG-Fc (RF absorbent, obsažený v TRIS pufru), proběhne imunitní reakce na testovací destičce při souběžné inkubaci konjugátu antigenu Toxoplasma gondii s POD a vzorku. Inkubace se provádí 60 min při 37 °C. Po promytí fosfátovým pufrem (4x) se přidá tetrametylbenzidin. Enzymatická část konjugátu způsobí modré zabarvení tetrametylbenzidinu. Reakce probíhá při 18 – 25 °C 30 min ve tmě. Tato reakce je zastavena přidáním zastavovacího roztoku, který způsobí žluté zabarvení. Sytost barvy je měřítkem imunochemické reaktivity specifických IgM protilátek proti Toxoplasmě gondii obsažených ve vzorku. Absorbance se měří do 60 min při 450/615-690 nm. Pro jednotlivé soupravy je uvedený korekční faktor k výpočtu cut-off. Hemolytické, lipemické a ikterické vzorky neovlivňují výsledek testu. Preciznost v sérii 5,1 – 8,9 %, mezi sériemi 9,8 – 16,7 %. Senzitivita byla 98,4 %, specificita 99,3 %.

ELISA IgA Po předběžném ošetření ředěných vzorků (15 min při 15 – 25 °C) protilátkou vůči lidskému IgG (IgG-RF sorbent), proběhne imunitní reakce. Specifické protilátky proti Toxoplasmě gondii obsažené v testovaném vzorku se po pipetování váží na inaktivní antigen Toxoplasma gondii v reakčních jamkách testovací destičky. Inkubace se provádí 60 min při 37 °C. Po promytí pufrem (5x) se přidá konjugát POD a protilátky vůči lidskému IgA, který se váže na tyto specifické protilátky. Inkubace se provádí 30 min při 20 – 25 °C ve tmě. Po promytí pufrem (5x) se přidá tetrametylbenzidin. Enzymatická část konjugátu způsobí modré zabarvení tetrametylbenzidinu. Reakce probíhá při 20 – 25 °C 15 min ve tmě. Tato reakce je zastavena přidáním zastavovacího roztoku zředěné H₂SO₄ (0,2 mol/l), který způsobí žluté zabarvení. Sytost barvy je měřítkem imunochemické reaktivity specifických IgA protilátek proti Toxoplasmě gondii obsažených ve vzorku. Absorbance se měří do 30 min při 450/620 nm. Měřením cut-off kalibrátoru v dubletu se určí cut-off. Výsledky < 0,9 cutoff jsou negativní, výsledky > 1,1 cutoff jsou pozitivní, mezitím je šedá zóna.

Nepřímá imunofluorescence IgG Nátěr antigenu Toxoplasma gondii byl ekvilibrován na laboratorní teplotu. Do jamek destiček byla pipetována analyzovaná séra (ředěná 1:100 a dále dvojkovou řadou). Po inkubaci 30 min za laboratorní teploty, vypláchnutí a promývání fosfátovým pufrem (3x) byl přidán konjugát fluorescein izotiokyanátu s polyklonální kozí protilátkou vůči lidskému IgM. Následovala další inkubace 30 min za laboratorní teploty. Pak byly vzorky promyty (2x), překryty glycerolovým médiem s fosfátovým pufrem a analyzovány ve fluorescenčním mikroskopu. Vzorky se hodnotí buď na 1 až 4 kříže, nebo se provádí ředění v dvojkové řadě od 1:100 a titr nepřímé fluorescence (excitace 488 nm, emise 530 nm) byla hodnota ředění, při které došlo k fluorescenci hodnocené na 1+. Některé soupravy začínají dvojkovou ředící řadu už při 1:16.

Nepřímá imunofluorescence IgM V první části testu se ze séra odstraní IgG protilátky (precipitací s lidským IgG) a revmatoidní faktor. Nátěr antigenu Toxoplasma gondii byl ekvilibrován na laboratorní teplotu. Do jamek destiček byla pipetována analyzovaná séra (ředěná 1:10 a dále dvojkovou řadou). Po inkubaci 60 min při 37 °C, vypláchnutí a promývání fosfátovým pufrem (2x) byl přidán konjugát fluorescein izotiokyanátu s polyklonální králičí protilátkou vůči lidskému IgG. Následovala další inkubace 30 min při 37 °C. Pak byly vzorky promyty (2x), překryty glycerolovým médiem s fosfátovým pufrem a analyzovány ve fluorescenčním mikroskopu. Vzorky se hodnotí buď na 1 až 4 kříže, nebo se provádí ředění v dvojkové řadě od 1:10 a titr nepřímé fluorescence (excitace 488 nm, emise 530 nm) byla hodnota ředění, při které došlo k fluorescenci hodnocené na 1+. Relativní senzitivita 92,3 %, relativní specificita 100 %.

Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) IgG protilátek kvantitativně probíhá tak, že se do reakční nádobky dávkuje ředěný vzorek a poté latexové mikročástice potažené antigenem Toxoplasmy gondii a pufr. Po inkubaci se reakční směs přenese na fritu a nenavázaný materiál se oddělí promytím. Přidá se konjugát kozích protilátek vůči lidskému IgG značený ALP. Po inkubaci a promytí se dávkuje substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí na fluoreskující umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky (excitace 365 nm, emise 448 nm). Šestibodová kalibrace je v rozsahu 0 – 300 kU/l. Vzorky s koncentrací IgG protilátek > 300 kU/l se ředí automaticky 10x. Výsledky < 2 kU/l jsou negativní, výsledky ≥ 3 kU/l jsou pozitivní, mezitím je šedá zóna na protilátky IgG vůči Toxoplasmě gondii. Preciznost v sérii je 5,5 – 9,2 %, celková preciznost metody je 7,6 – 11,5 %. Relativní senzitivita 98,8 %, relativní specificita 98,2 %. Stejný princip může být použitý i u jiného postupu, pouze s tím rozdílem, že antigenem Toxoplasmy gondii nejsou potažené latexové mikročástice, ale vnitřní stěny špiček, na kterých se zachytí protilátka (jako substrát se používá 4-metylumbeliferylfosfát + dietanolamin).

Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) IgM protilátek kvalitativně probíhá tak, že se vzorek naředí s pufrem pro neutralizaci revmatoidního faktoru a do reakční nádobky se dávkuje upravený vzorek a poté latexové mikročástice potažené antigenem Toxoplasmy gondii. Po inkubaci se reakční směs přenese na fritu a nenavázaný materiál se oddělí promytím. Přidá se konjugát kozích protilátek vůči lidskému IgM značený ALP. Po inkubaci a promytí se dávkuje substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí na fluoreskující umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky (excitace 365 nm, emise 448 nm). Pro kvalitativní hodnocení se používá indexový kalibrátor. Vzorky s indexem < 0,5 vůči kalibrátoru jsou negativní, ≥ 0,6 jsou pozitivní a mezi těmito hodnotami jsou neurčité na přítomnost IgM protilátek vůči Toxoplasmě gondii. Preciznost v sérii je 4,4 – 7,4 %, celková preciznost metody je 6,5 – 13,5 %. Relativní senzitivita 92,1 %, relativní specificita 99,3 %. Stejný princip může být použitý i u jiného postupu, pouze s tím rozdílem, že antigenem Toxoplasmy gondii nejsou potažené latexové mikročástice, ale vnitřní stěny špiček, na kterých se zachytí protilátka (jako substrát se používá 4-metylumbeliferylfosfát + dietanolamin).

Chemiluminiscenční analýza IgG protilátek v dvojstupňovém sendvičovém uspořádání používá paramagnetické částice potažené rekombinantním antigenem Toxoplasmy gondii, na který se naváží protilátky ze vzorku. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá konjugát myších monoklonálních protilátek vůči lidskému IgG s akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je přímo úměrná hladině IgG protilátek a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Šestibodová kalibrace je v rozsahu 1,6 – 200 kU/l. Vzorky s koncentrací IgG protilátek > 200 kU/l se ředí automaticky 10x. Preciznost v sérii je 2,2 – 3,1 %, celkově 2,6 – 4,0 %. Funkční senzitivita je < 1,6 kU/l. Relativní senzitivita je 99,2 %, relativní specificita 99,0 %. Při stanovení neruší hemoglobin 5 g/l, bilirubin 342 µmol/l, ani triacylglyceroly 33,9 mmol/l.

Chemiluminiscenční analýza IgM protilátek v dvojstupňovém sendvičovém uspořádání používá paramagnetické částice potažené myšími monoklonálními protilátkami vůči lidskému IgM, na které se naváží protilátky IgM ze vzorku. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá konjugát myších monoklonálních protilátek vůči antigenu p30 Toxoplasmy gondii s lyzátem Toxoplasmy gondii (obsahuje antigen p30), značený akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je přímo úměrná hladině IgG protilátek a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Průměrná hodnota tripletu stanovení kalibrátoru je cut-off. Vzorky s koncentrací IgM protilátek < 0,5 cut-off jsou negativní, vzorky s koncentrací IgM protilátek  ≥ 0,6 cut-off jsou pozitivní, mezitím je šedá zóna. Preciznost v sérii je 2,9 – 3,3 %, celkově 3,1 – 3,8 %. Relativní specificita 94,9 %. Při stanovení neruší hemoglobin 5 g/l, bilirubin 342 µmol/l, ani triacylglyceroly 33,9 mmol/l. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýzách in vitro.

Podobný princip zábleskové luminiscence v sendvičovém uspořádání lze použít s esterem akridinu jako značkou pro IgG protilátky vůči Toxoplasmě gondii. Ke vzorku se přidají paramagnetické latexové částice s kovalentně vázanou monoklonální myší protilátkou vůči Fc fragmentu lidského IgG a inkubuje 18 min při 37 °C. Následuje odsátí roztoku, promytí zkumavek a pak se přidá antigen Toxoplasmy gondii s monoklonální myší protilátkou vůči p30 antigenu Toxoplasmy gondii, značenou esterem akridinu. Po inkubaci 18 min při 37 °C následuje odsátí roztoku a promytí zkumavek; přidá se peroxid vodíku + roztok NaOH a ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk (intenzita signálu je přímo úměrná množství IgG protilátek) fotonásobičem při 429 nm. Na základě dvoubodové kalibrace jsou vzorky s koncentrací < 6,4 kU/l negativní, 6,4 – 9,9 kU/l hraniční a ≥ 10 kU/l pozitivní na IgG protilátky vůči Toxoplasmě gondii. Preciznost v sérii je 1,3 – 6,4 %, celkově 2,3 – 7,3 %. Relativní senzitivita je 94,1 %, relativní specificita 99,3 %. Koncentrace hemoglobinu 5 g/l, triacylglycerolů 11,3 mmol/l a bilirubinu 684 µmol/l interferují ≤ 10 %. Přítomnost antinukleárních protilátek a antimitochondriálních protilátek ve vzorcích pacientů s autoimunitním syndromem může narušovat funkci stanovení Toxoplasmy gondii IgG a vést k falešně pozitivním nebo falešně negativním výsledkům.

Princip zábleskové luminiscence v sendvičovém uspořádání lze použít s esterem akridinu jako značkou také pro IgM protilátky vůči Toxoplasmě gondii. Ke vzorku se přidají paramagnetické latexové částice s kovalentně vázanou monoklonální protilátkou vůči lidskému IgM a inkubuje se 18 min při 37 °C. Následuje odsátí roztoku a promytí zkumavek; přidá se antigen Toxoplasmy gondii s monoklonální myší protilátkou vůči p30 antigenu Toxoplasmy gondii, značenou esterem akridinu a inkubuje se 18 min při 37 °C. Následuje odsátí roztoku a promytí zkumavek, přidá se peroxid vodíku + roztok NaOH a ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk (intenzita signálu je přímo úměrná množství IgM protilátek) fotonásobičem při 429 nm. Na základě dvoubodové kalibrace se určí hodnota cutoff. Vzorky s indexem < 0,9 jsou negativní, 0,9 – 0,99 jsou neurčité a ≥ 1,0 jsou pozitivní na IgM protilátky vůči Toxoplasmě gondii. Preciznost v sérii je 2,2 – 12,2 %, celkově 2,9 – 12,8 %. Relativní senzitivita je 98,0 %, relativní specificita 97,5 %. Koncentrace hemoglobinu 5 g/l, triacylglycerolů 11,3 mmol/l a bilirubinu 684 µmol/l interferují ≤ 10 %. Heterofilní protilátky mohou interferovat při analýze a způsobit falešně negativní nebo falešně pozitivní výsledky.

Jiné stanovení IgG protilátek vůči Toxoplasmě gondii je založeno na sendvičové imunochemické reakci se sledováním luminiscence zesílené enzymem. Protilátky vůči Toxoplasmě gondii ze vzorku se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váží na inaktivovaný antigen Toxoplasmy gondii, imobilizovaný na polystyrénové kuličce. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytím se na druhé vazebné místo antigenu naváže myší monoklonální protilátka vůči lidskému IgG konjugovaná s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření 425 – 500 nm je přímo úměrná koncentraci IgG protilátek vůči Toxoplasmě gondii ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Rozsah kalibrace je 5 – 250 kU/l. Analytická citlivost je ≤ 5 kU/l. Vzorky s koncentrací IgG protilátek < 6,5 kU/l se považují za nereaktivní, 6,5 – < 8 kU/l jsou neurčité a ≥ 8 kU/l jsou reaktivní na IgG protilátky vůči Toxoplasmě gondii. Preciznost v sérii 4,7 – 6,6 %, celková 8,6 – 19,3 %. Relativní specificita 99 %. Ani koncentrace hemoglobinu 5,4 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší. Heterofilní protilátky mohou ovlivňovat výsledky analýzy.

Také průkaz IgM protilátek vůči Toxoplasmě gondii je založen na sendvičové imunochemické reakci se sledováním luminiscence zesílené enzymem. Protilátky vůči Toxoplasmě gondii ze vzorku se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váží na polystyrénovou kuličku s monoklonální myší protilátkou vůči lidskému IgM.  Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytím se na druhé vazebné místo protilátky vůči Toxoplasmě gondii váže p30 antigen Toxoplasmy gondii konjugovaný s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření 425 – 500 nm je přímo úměrná koncentraci IgM protilátek vůči Toxoplasmě gondii ve vyšetřovaném vzorku. Cutoff hodnota se získá z průměru výsledků pro kalibrátor. Vzorky s koncentrací IgM protilátek < 0,9 cutoff se považují za nereaktivní, 0,9 – < 1,1 cutoff jsou neurčité a ≥ 1,1 cutoff jsou reaktivní na IgM protilátky vůči Toxoplasmě gondii. Preciznost v sérii 3,5 – 4,9 %, celkem 3,1 – 8,0 %. Relativní senzitivita je 94,7 %, relativní specificita 97,7 %. Ani koncentrace hemoglobinu 5,4 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší. Heterofilní protilátky mohou ovlivňovat výsledky analýzy.

Další postup ke stanovení IgG protilátek používá podobný luminogen Lumi-Phos 530 v dvojstupňové reakci. Do zkumavky se pipetují paramagnetické částice potažené membránovým antigenem Toxoplasma gondii a standard nebo vzorek. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Během druhé inkubace se přidá myší monoklonální protilátka vůči lidskému IgG značená ALP. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky.  Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je přímo úměrné množství IgG protilátek vůči Toxoplasmě gondii. První výsledek se získá po 35 min. Detekční limit je 3,2 kU/l IgG protilátek. Vzorky s koncentrací IgG protilátek < 7,5 kU/l se považují za nereaktivní, 7,5 – < 10,5 kU/l jsou neurčité a ≥ 10,5 kU/l jsou reaktivní na IgG protilátky vůči Toxoplasmě gondii. Rozsah měření na základě šestibodové kalibrace je 3,2 – 450 kU/l. Preciznost v sérii 3,3 – 12,2 %, mezi sériemi 3,9 – 17,0 %; linearita ředění byla 87,0 – 107,1 %. Vysoké koncentrace hemoglobinu (20 g/l), bilirubinu (513 µmol/l) a triacylglycerolů (33,9 mmol/l) neruší při analýze. Heterofilní protilátky mohou ovlivňovat výsledky analýzy.

Další postup k průkazu IgM protilátek používá podobný luminogen Lumi-Phos 530 v dvojstupňové reakci. Do zkumavky se pipetují paramagnetické částice potažené ovčí polyklonální protilátkou vůči lidskému IgM a standard nebo vzorek. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Během druhé inkubace se přidá komplex antigenu Toxoplasmy gondii a myší monoklonální protilátky vůči p30 Toxoplasmy gondii, značené ALP. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky.  Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je přímo úměrné množství IgM protilátek vůči Toxoplasmě gondii. Doba analýzy je 35 min. Cutoff se určí analýzou obou kalibrátorů. Vzorky s koncentrací IgM < 0,8 cut-off se považují za nereaktivní, 0,8 – < 1,0 cut-off jsou neurčité a ≥ 1,0 jsou reaktivní na IgG protilátky vůči Toxoplasmě gondii. Preciznost v sérii 3,0 – 4,7 %, mezi sériemi 7,0 – 12,9 %. Relativní senzitivita je 88,8 %, specificita je 98,8 %. Heterofilní protilátky mohou ovlivňovat výsledky analýzy.

Chemiluminiscenční analýza IgG protilátek v dvojstupňovém sendvičovém kvantitativním provedení, kdy se protilátky vůči Toxoplasmě gondii ze vzorku váží na antigen Toxoplasmy gondii, kterým jsou potaženy jamky mikrotitrační destičky. Po inkubaci (37 °C) se promytím odstraní volný materiál a přidá se myší monoklonální protilátka vůči lidskému IgG značená křenovou peroxidázou. Po inkubaci (37 °C) se promytím odstraní volný materiál a přidá se luminogen (derivát luminolu + sůl peroxykyseliny) jehož oxidaci katalyzuje POD za vzniku světla. Celkově trvá inkubace 24 min a první výsledek je k dispozici za 35 min. Činidlo pro přenos elektronů (substituovaný acetanilid) zvyšuje hladinu uvolněného světla a prodlužuje jeho emisi. Signál je přímo úměrný koncentraci IgG protilátek vůči Toxoplasmě gondii ve vzorku. Kalibrační křivka se adjustuje ze vzorové křivky po analýze tří kalibrátorů. Měřící rozsah je 2,72 – 500 kU/l IgG protilátek, vyšší koncentrace jsou automaticky ředěné 10x. Detekční limit je 2,72 kU/l IgG protilátek. Vzorky s koncentrací IgG protilátek < 4 kU/l se považují za nereaktivní, 4 – < 8 kU/l jsou neurčité a ≥ 8 kU/l jsou reaktivní na IgG protilátky vůči Toxoplasmě gondii. Preciznost v sérii je 3,1 – 4,9 %, mezi sériemi je 5,2 – 12,3 %. Relativní senzitivita je 99,2 %, relativní specificita 99,2 %. Vysoké koncentrace hemoglobinu (5 g/l), bilirubinu (342 µmol/l) a triacylglycerolů (33,9 mmol/l) neruší při analýze. Nelze použít zakalené vzorky. Heterofilní protilátky mohou ovlivňovat výsledky analýzy.

Chemiluminiscenční analýza IgM protilátek v dvojstupňovém sendvičovém kvalitativním provedení, kdy se IgM ze vzorku váží na biotinylovanou myší IgM protilátku, která se zachytí na streptavidin v jamkách mikrotitrační destičky. Po inkubaci (37 °C) se promytím odstraní volný materiál a přidá se konjugát inaktivního antigenu Toxoplasmy gondii s F(ab)₂ fragmentem myší monoklonální protilátky vůči Toxoplasmě gondii, značené křenovou peroxidázou. Po inkubaci (37 °C) se promytím odstraní volný materiál a přidá se luminogen (derivát luminolu + sůl peroxykyseliny) jehož oxidaci katalyzuje POD za vzniku světla. Celkově trvá inkubace 32 min a první výsledek je k dispozici za 43 min. Činidlo pro přenos elektronů (substituovaný acetanilid) zvyšuje hladinu uvolněného světla a prodlužuje jeho emisi. Signál je přímo úměrný koncentraci IgM protilátek vůči Toxoplasmě gondii ve vzorku. Cutoff hodnota se určí měřením jednoho kalibrátoru v dubletu a násobí se faktorem specifickým pro danou šarži reagencií. Vzorky s koncentrací IgM protilátek < 0,8 cutoff se považují za negativní, ≥ 0,8 – < 1,2 cutoff jsou hraniční a ≥ 1,2 cutoff jsou reaktivní na IgM protilátky vůči Toxoplasmě gondii. Preciznost v sérii 2,2 – 13,2 %, mezi sériemi je 2,5 – 11,7 %. Relativní senzitivita je 95,3 %, relativní specificita 99,1 %. Vysoké koncentrace hemoglobinu (5 g/l), bilirubinu (342 µmol/l) a triacylglycerolů (33,9 mmol/l) neruší při analýze. Nelze použít zakalené vzorky. Heterofilní protilátky mohou ovlivňovat výsledky analýzy. Hladina biotinu v séru je zvýšená až 24 h od jeho podání.

Stanovení IgG protilátek elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (10 µl) je inkubován s biotinylovaným rekombinantním antigenem Toxoplasmy gondii a rekombinantním antigenem Toxoplasmy gondii, značeným ruthéniovým komplexem. Pak se přidají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem, na které se naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Po inkubaci se reakční směs nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Luminiscence je přímo úměrná hladině IgG protilátek vůči Toxoplasmě gondii ve vzorku. Provádí se dvoubodová kalibrace a na jejím základě se adjustuje kalibrační křivka v rozsahu 0,13 – 650 kU/l IgG protilátek (vyšší koncentrace se ředí 20x). Detekční limit je 0,13 kU/l. Vzorky s koncentrací IgG protilátek < 1 kU/l se považují za nereaktivní a ≥ 3 kU/l jsou reaktivní na IgG protilátky vůči Toxoplasmě gondii, mezitím je šedá zóna. Preciznost v sérii 1,3 – 2,5 %, mezi sériemi 2,7 – 5,7 %. Relativní senzitivita 97,5 %, relativní specificita je 96,8 %. Hemolýza (hemoglobin 20 g/l), chylozita (triacylglyceroly 22,6 mmol/l), ikterus (bilirubin 684 µmol/l) a RF (< 6210 kIU/l) neruší. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměli odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Vzácně mohou interferovat protilátky vůči streptavidinu nebo rutheniu. Aviditu IgG protilátek vůči Toxoplasmě gondii lze hodnotit po předběžné úpravě vzorku s diluentem obsahujícím rekombinantní antigen Toxoplasmy gondii. S upraveným a neupraveným vzorkem se provede ECLIA a z jejich poměru se vypočte avidita v %. Nízká avidita je < 70 %, vysoká avidita ≥ 80 %, mezitím je šedá zóna.

Průkaz IgM protilátek elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (10 µl) je inkubován s rekombinantním antigenem Toxoplasmy gondii, značeným ruthéniovým komplexem. Pak se přidají biotinylované monoklonální myší protilátky vůči lidskému IgM a paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem, na které se naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Po inkubaci se reakční směs nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Luminiscence je přímo úměrná hladině IgM protilátek vůči Toxoplasmě gondii ve vzorku. Provádí se dvoubodová kalibrace a na jejím základě se vypočítá cutoff. Vzorky s koncentrací IgM protilátek < 0,8 cutoff se považují za nereaktivní, 0,8 – < 1,0 cutoff za neurčité a ≥ 1,0 cutoff jsou reaktivní na IgM protilátky vůči Toxoplasmě gondii. Preciznost v sérii 0,9 – 2,2 %, mezi sériemi 1,6 – 5,4 %. Relativní senzitivita 91,7 %, relativní specificita je 97,8 %. Hemolýza (hemoglobin 20 g/l), chylozita (triacylglyceroly 22,6 mmol/l), ikterus (bilirubin 684 µmol/l) a RF (< 3720 kIU/l) neruší. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměli odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Vzácně mohou interferovat protilátky vůči streptavidinu nebo rutheniu.

Western blot dovoluje prokázat IgG, IgM i IgA protilátky vůči Toxoplasmě gondii. IgG protilátky reaguje s polypeptidy v rozmezí 14000 – 150000. IgM zejména s polypeptidy 25000 a 35000. IgA má podobnou reakci jako IgM, ale navíc reaguje s polypeptidy 30000, 32000 a 40000. Extrakt tachyzoitů Toxoplasmy gondii v roztoku TRIS, glycerolu, laurylsíranu, EDTA a ditiotreitolu. Provedla se elektroforéza na polyakrylamidovém gelu s laurylsíranem sodným. Rozdělené bílkoviny byly přeneseny na nitrocelulózový papír v roztoku TRIS-glycin-20 % metanol. Po přenosu byla membrána blokována 5 % odstředěným práškovým mlékem ve fosfátovém pufru po dobu 60 min, promyta 3x fosfátovým pufrem a rozřezána na proužky 3 mm. Všechny další kroky byly prováděné za laboratorní teploty a třepání. Proužky pro imunoblot byly umístěny do jednotlivých korýtek blotovacího tácu a inkubovány 1 h s kozí protilátkou vůči lidskému IgG nebo vůči lidskému IgM. Po promytí (3x) byl přidán tetrametylbenzidin a sledovaly se modře zbarvené pruhy.

Mezinárodní standard: Anti-Toxoplasma Serum WHO (3rd International Standard, 1994, NIBSC code TOXM).

Hodnoty snižuje: protilátky IgM mohou být falešně negativní při vysokých hodnotách anti-Toxo-IgG.

Hodnoty zvyšuje: Protilátky IgM jsou falešně pozitivní u zvýšení revmatoidního faktoru, přítomnosti antikoagulancií, bakteriální kontaminaci, hemolytických a chylózních vzorků.