L-tyroxin, thyroxin, tonne, liothyronin,
T4
3,5,3´,5´-tetrajódtyronin
Při analýze se dává přednost séru. Plazmu lze také použít (antikoagulans EDTA nebo heparin), ale po zamrazení a rozmrazení jeví sklon ke vzniku fibrinu a může mechanicky interferovat zejména při analýzách na automatických analyzátorech. Opakované zamrazení se nedoporučuje. Nebyly pozorovány žádné rozdíly při zpracování vzorku bez separačního gelu nebo se separačním gelem (jiný pramen uvádí, že rozdíly pozorovány byly).
Stabilita vzorku: T4 je dosti stabilní, koncentrace se nemění ani po 14 dnech za laboratorní teploty. Nicméně se doporučuje sérum zamrazit, pokud se neanalyzuje do 24 h. Většina souprav je určena pro stanovení T4 v séru nebo plazmě a nemůže být využita ke stanovení v moči nebo likvoru, protože reakce antigenu s protilátkou extrémně závisí na matrici měřeného vzorku.
Stabilita v séru: 20 - 25 °C: 1 – 2 dny, 4 - 8 °C: 2 – 10 dní, -20 °C: 1 – 6 měsíců. Výsledky ovlivňuje věk. Biologický poločas v plazmě 5 – 8 dnů.
Hemolýza při analýze nevadí, ale je třeba se vyhnout silné hemolýze, kdy by mohlo jejím vlivem docházet
k naředění vzorku. Silně lipemické vzorky by neměly být analyzovány, protože mastné kyseliny soutěží s T4
o vazebná místa na TBG. Ojediněle se mohou projevit protilátky proti fluoresceinu, které mohou způsobit falešně vysoké výsledky FPIA.
Při RIA je třeba, aby nebyly pacientovi podávány v rámci terapie radionuklidy po dobu 14 dnů. Zvýšené autoprotilátky vůči T4 mohou ovlivnit stanovení T4. Falešné zvýšení je u metod, kde dochází k vazbě protilátek na pevnou fázi (naprostá většina metod) a ke snížení, vzniká-li imunokomplex v roztoku (imunoseparace volné fáze na pryskyřici).
Metoda na principu kompetitivní vazby na proteiny (competitive protein-binding assay CPBA) sleduje soutěž T4 ze séra a T4 značeného 125I o omezený počet vazebných míst na TBG. Protože je 99,97 % T4 vázáno na TBG
a jiné bílkoviny, je třeba zajistit, aby bylo konstantní množství TBG v každé zkumavce. To vyžaduje extrahovat T4 ze vzorku etanolem a současně odstranit z něj TBG. To je časově náročné a proto byla CPBA nahrazena automatizovanými imunoanalýzami (extrakce se obešla použitím blokačních činidel jako jsou
8-anilinonaftalensulfonová kyselina, salicylát sodný nebo thimerosal, tj. merthiolát – kdy se selektivně blokuje vazba T4 na TBG, aniž se ovlivní interakce T4 s protilátkou), kdy se jako markery používají 125I, nebo mnohem více neizotopové značky jako enzymy, fluoreskující a luminiscenční molekuly. Vyšší citlivost a specifita se dosahují použitím antiséra s vysokou afinitou. Afinitní konstanta může být 10-14 l/mol. Křížová reaktivita látek se strukturou podobnou T4 je zanedbatelná. Již v roce 2001 měřilo 99 % laboratoří v USA T4 neizotopovými metodami.
RIA je heterogenní postup, vyžadující oddělení volného a vázaného radioligandu. Značkou je 125I. Nejvíce se využívá separace na pevné fázi, kdy je protilátka vůči T4 vázaná na pevnou podložku jako jsou skleněné kuličky, plastové zkumavky, celulóza nebo magnetické částice. Lze také použít druhé protilátky anebo polyetylenglykolu k vysrážení imunokomplexu. Běžný detekční limit RIA je 5 nmol/l, ale proměření v dialyzátu se používají citlivější postupy s detekčním limitem 2 nmol/l. Při koncentraci 49 nmol/l je CV mezi sériemi ±7 %. Křížová reaktivita T3 při zastoupení 50 % byla 5 %. Preciznost v sérii dosáhla CV 2,7 – 3,8 %, mezi sériemi 4,2 – 14,5 %. Odezva na ředění 93 – 103 %.
Technika EMIT je homogenní enzymová imunoanalýza, která nevyžaduje separační krok. Jako značka se používá glukóza-6-fosfátdehydrogenáza kovalentně vázaná na T4. Enzym v konjugátu je inaktivní po vazbě na specifickou protilátku vůči T4, pravděpodobně v důsledku stérické zábrany. Takže množství konjugátu vázaného do imunokomplexu je nepřímo úměrné enzymové aktivitě a může být měřeno bez separace volného
a vázaného T4. Enzymová aktivita je přímo úměrná množství T4, přítomnému ve vzorku a stanovuje se oxidací glukóza-6-fosfátu zpraženou s redukcí NAD+ na NADH. Nevýhodou homogenní vůči heterogenní imunoanalýze je, že vzorek séra často vyžaduje úpravu alkalizací, aby se eliminoval vliv vlastní sérové enzymové aktivity na měření. Rozsah metody 6,4 – 309 nmol/l. Analytická citlivost 6,4 nmol/l. Preciznost metody v sérii je CV 5,1 – 6,4 %, mezi sériemi 7,7 – 11,6 %.
Metoda CEDIA je také homogenní enzymová imunoanalýza. Postup je založený na vzniku aktivního enzymu ze dvou inaktivních fragmentů β-galaktozidázy: enzymového donoru a enzymového akceptoru (získaného DNA technologii). T4 je navázán kovalentně navázán na enzymový donor takovým způsobem, že může docházet
k samovolnému spojení donoru a akceptoru. Při vzniku imunokomplexu donor-T4-protilátka je ale spojení donoru s akceptorem inhibováno. T4 ze vzorku soutěží s donorem označeným T4 o specifickou protilátku vůči T4. Katalytická aktivita vznikající β-galaktozidázy (donor + akceptor) je přímo úměrná koncentraci T4 ve vzorku. Detekční limit 6,45 nmol/l. Rozsah metody 6,45 – 258 nmol/l. Preciznost metody v sérii je CV 1,7 – 5,1 %, mezi dny 2,6 – 9,2 %; výtěžnost 100 – 103 %. Odezva na ředění 98 – 107 %.
Heterogenní enzymová imunoanalýza ke stanovení T4 je také v kompetitivním uspořádání a obvykle používá jako značku křenovou peroxidázu. Ovčí protilátka vůči T4 je zakotvená v jamkách mikrotitračních destiček. Po konkurenční imunoreakci T4 ze séra a konjugátu T4 s POD se jamky vymyjí a přidá se substrát tetrametylbenzidin. Barevná reakce se zastaví 1M HCl a absorbance se měří při 450 nm vertikálním fotometrem. Detekční limit metody je 5,16 nmol/l. Rozsah měření je do 322 nmol/l. Reprodukovatelnost v sérii dosahuje CV 1,4 – 2,9%, mezi sériemi 2,7 – 3,9 %. Výtěžnost metody je 86 – 105 %.Odezva na ředění 92 –
109 %.
Homogenní fluorescenční imunoanalýza využívá ke stanovení T4 fluorescenční polarizace (FPIA). T4 označený fluoresceinem a T4 ze vzorku soutěží o vazebná místa specifické protilátky. Množství emitovaného polarizovaného světla při 525 – 550 nm (excitace 485 nm) závisí na tom kolik konjugátu T4 s fluoresceinem se naváže na protilátku. Polarizované světlo ze značeného imunokomplexu, který je velký a rotuje pomalu bude mnohem větší, než z rychle rotujícího malého konjugátu. Vlivem T4 ze vzorku je množství fluoresceinu
v imunokomplexu menší a polarizovaný signál slabší. Takže tímto postupem lze stanovit koncentraci T4
ve vzorku, která je nepřímo úměrná emitovanému polarizovanému světlu při FPIA. Detekční limit metody byl
25 nmol/l. Reprodukovatelnost v sérii měla CV 1,82 – 5,02 %, mezi sériemi 0,89 – 4,54 %, celkově 2,77 –
6,74 %. Křížová reaktivita T3 byla < 10 %.
Heterogenní fluorescenční imunoanalýza (fluorometric enzyme immunoassay FEIA) je radiální rozdělovací technika, kdy se celý imunochemický postup provádí na pevné fázi. Protilátka specifická vůči T4 je imobilizována na malé plošce filtračního papíru ze skleněných vláken. Jako marker slouží T4 značený ALP. T4 ze vzorku a konjugát ALP-T4 se nechají postupně reagovat s imobilizovanou protilátkou. Po inkubaci se provede promytí roztokem obsahujícím 4-metylumbeliferylfosfát (fluorogenní substrát). Substrát se ALP defosforyluje na 4-metylumbeliferon a současně se promývacím roztokem vymyje volný T4 z plochy, kde je měřena fluorescence (plocha s imobilizovanou protilátkou). 4-Metylumbeliferon vytvořený ALP je fluorochrom. Intenzita fluorescence je nepřímo úměrná koncentraci T4 ve vzorku a je měřena fluorimetrem.
Fluorescence rozložená v čase je heterogenní kompetitivní postup s použití chelátů europia jako značky. Excitační světlo je 340 nm, emisní pík europia 613 nm. Reakce probíhá v mikrotitračních destičkách. Imunokomplex s monoklonální protilátkou vůči T4 je pak zachycen pomocí druhé protilátky vůči myšímu IgG, kterou jsou potaženy stěny jamek. Po promytí jsou ionty europia disociovány z vázané fáze a vytvoří intenzivně fluoreskující chelát, jehož fluorescence je nepřímo úměrná množství T4 ve vzorku. Reprodukovatelnost v sérii má CV 2,9 – 6,3 %, mezi sériemi 5,5 – 7,0 %; výtěžnost 95 – 106 %. Analytická citlivost metody je 5 nmol/l. Rozsah měření do 300 nmol/l. Křížová reaktivita při 50 % zastoupení: D-tyroxin 56 %, kyselina
3,3´,5-trijódothyrooctová 14 %, 3,3´,5-L-trijódtyronin 5,2 %.
Fluorescence s použitím suchých činidel je metoda založená na měření signálu imunokomplexu protilátky značené rhodaminem s T4. Sérum se nanese na film, kde je T4 vytěsněn ze svých vazebných proteinů. Volný T4 pak prochází přes další vrstvu, kde vytěsní rhodaminem značený T4 z imobilizované protilátky.
Luminiscenční imunoanalýza (LIA) s esterem akridinu jako markerem je v kompetitivním uspořádání. T4 ze vzorku soutěží s T4 navázaným na paramagnetické částice o omezený počet vazebných míst na specifické protilátce označené esterem akridinu. Po krátké inkubaci jsou paramagnetické částice odděleny
v magnetickém poli a promyty, aby se odstranila volná protilátka s esterem akridinu. Pak jsou částice suspendovány v roztoku peroxidu vodíku a chemiluminiscenční reakce je nastartována po nástřiku roztoku hydroxidu sodného do suspenze, čímž dochází k oxidaci esteru akridinu a emisi luminiscence. Intenzita luminiscence detekovaná luminometrem při 400 nm je nepřímo úměrná koncentraci T4 ve vzorku. Metoda je použitelná bez ředění do 387 nmol/l. Mez detekce je 3,9 nmol/l; výtěžnost 92,0 – 112,5 %. Odezva po ředění
90 – 111,4 %. Preciznost v sérii CV 1,19 – 3,15 %, mezi sériemi 1,47 – 4,57 %, celkem 1,89 – 5,55 %. D-tyroxin se má vysokou interferenci 57,7 %, reverzní trijódtyronin 2,7 %, L-trijódtyronin 1,2 %.
LIA stanovení s využitím volného substrátu je založeno na kompetitivní imunochemické reakci. Na polystyrénové kuličce v reagenční zkumavce je navázána myší monoklonální protilátka proti lidskému tyroxinu. Kulička se inkubuje 30 minut se vzorkem a alkalickou fosfatázou značeným tyroxinem, kdy dochází ke konkurenční reakci. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se ihned rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření je nepřímo úměrná koncentraci T4 ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané
z čárového kódu činidla. Rozsah metody je 13 – 309 nmol/l. Analytická citlivost 5 nmol/l. Preciznost v sérii 6,3 – 8,4 %, mezi sériemi 6,7 – 9,8 %; odezva na ředění 95 – 109 %, výtěžnost: 103 - 111 %.
Elektrochemiluminiscence (ECLIA) následuje po imunoreakci na kompetitivním principu, kdy se vzorek inkubuje s biotinem značeným T4 a soutěží o specifickou protilátku, značenou ruthéniovým komplexem
a vzniká sendvičový imunokomplex. Přidají se paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem, na který se naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se paramagnetické mikročástice zachytí magnetem na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Metoda je použitelná
v rozsahu 5,4 – 320 nmol/l. Detekční limit je 5,4 nmol/l. Reprodukovatelnost v sérii CV 1,3 – 4,7 %, mezi sériemi 2,7 – 6,9 %.
Imunoanalýza zesílená částicemi (particle-enhanced immunoassay PIA) se provádí tak, že se smísí vzorek
s konjugátem Ficoll-T4. Ficoll je roztok polysacharidu, který slouží jako aglutinační činidlo. Po krátké inkubaci se přidá protilátka vůči T4 navázaná na mikročástice a zahájí se aglutinační reakce mezi konjugátem T4
a protilátkou navázanou na mikročásticích. T4 ze vzorku snižuje podíl aglutinace, neboť soutěží s konjugátem
o vazebná místa protilátky zakotvené na mikročásticích. Míra aglutinace se měří při 600 nm turbidimetricky a je nepřímo úměrná množství T4 ve vzorku.
Plynová chromatografie s elektronovým záchytem používá derivatizace a N,O-diheptafluorobutyrylmetylesterové deriváty lze stanovit s mezí detekce 0,2 pg. Chromatografii předchází purifikace na katexu.
HPLC používá ke stanovení elektrochemický detektor.
Izotopová diluce s GCMS byla vyvinuta a navržena jako referenční metoda pro stanovení T4 v séru. Při tomto postupu se přidává určité množství T4 označeného 2H k fixnímu množství séra. T4 je pak izolován ze séra extrakcí, derivatizován na N,O-bis(trifluoracetyl)metylester a analyzován GCMS s héliem jako nosným plynem. Simultánně se přitom sledují ionty 799 a 801. Preciznost mezi sériemi dosahuje CV < 3,5 %.
Izotopová diluce s LCMS elektrosprejí používá jako vnitřní standard tyroxin-d5, který je přidáván do séra. Následuje vysrážení bílkovin a extrakce pevné fáze do etylacetátu. Jako mobilní fáze slouží 0,1 % kyselina octová v acetonitrilu ve směsi s vodou pro pozitivní ionty 778 a 783, resp. 0,2 % hydroxid amonný v metanolu
ve směsi s vodou pro negativní ionty 776 a 781. Na koloně C18 se ionty rozdělí. Reprodukovatelnost v sérii dosáhla 0,2 – 1,0 %. Detekční limit je 30 pg pro pozitivní a 20 pg pro negativní ionty.
National Institute of Standards and Technology připravil dva standardní referenční materiály (sérový pool dospělých mužů a sérový pool dospělých žen před menopauzou), obsahující také tyroxin s označením SRM 971. Hormony ve zmrazeném lidském séru jsou k dispozici od roku 2009.
Podle výsledků studie z USA 2001 se hodnoty preciznosti CV pohybují v intervalu 3 – 9 % pro vzorky
s průměrnou koncentrací 129 nmol/l. Laboratoře by měly pracovat (CLIA-88) s chybou ±20 % nebo
12,9 mmol/l. Intraindividuální variace T4 u zdravých je 3,5 % během jednoho týdne a 7,4 % během jednoho roku. Požadovaná analytická preciznost, odvozená ze studii biologické variace je 3,0 %.
Toleranční limit EHK: 13 %.
Koncentrace T4 je v séru snížena: androgeny, antikonvulsiva, citronan, dehydroepiandrosteron, dirastan, fenytoin, furosemid, hemolýza (silná), hladovění, kyselina gentisová, karbamazepin, kyselina hydroxyfenylpyrohroznová, kouření, lithium, močovina, oxalát, peritoneální dialýza, plazmaferéza, růstový hormon, sodanton, stres, thyreotom, aj.
Koncentrace T4 je v séru zvýšena: bilirubin (jen extrémní hodnoty), dijódtyrosin, erytropoetin, fenylbutazon, hemodialýza, heroin, kyselina trijódthyrooctová, kyselina trijódthyropropionová, menopauza, monojódtyrosin, obezita, prostaglandiny, thyreoidin, triacylglyceroly (EIA), aj.
Koncentrace T4 je v moči zvýšena během menstruace.
