BNP, brain natriuretic peptide, B-type natriuretic peptide, gamma-brain natriuretic peptide, Bnf, iso-ANP

Stanovení se provádí v plazmě (K₃EDTA s aprotininem 500 – 1000 kalikreinových jednotek/ml krve, lze použít také benzamidin). Před odběrem klid na lůžku 20 min. Odběr 2 – 5 dnů po akutním infarktu myokardu do vychlazených silikonovaných zkumavek, transport v ledové lázni. Separace erytrocytů v chlazené centrifuze do 1 h. Stabilita (plazma): 15 – 25 °C 4 – 6 h (okamžitá analýza?), 2 – 8 °C 6 – 24 h, -20° C 3 – 12 měsíců. Opakované rozmrazování se nedoporučuje.

Stanovení BNP se provádí imunochemicky soupravami nebo jednoúčelovými kazetami.

IRMA používá monoklonální protilátku vůči BNP vázanou na kuličky, na kterou se váže BNP ze vzorku a pak na něj druhá monoklonální protilátka vůči BNP značená ¹²⁵I. V soupravě jsou použity monoklonální protilátky proti dvěma různým epitopům molekuly BNP. Imunoradiometrické stanovení BNP (vytvoření sendviče) probíhá v jednom kroku. Nejprve se do zkumavek dávkují standardy a vzorky, pak druhá protilátka a nakonec kulička s první protilátkou. Zkumavky se jemně protřepou a nechají inkubovat 18 – 22 h při 2 – 8 °C. Po inkubaci se obsah zkumavek odsaje a dvakrát propláchne a odsaje. Vázaná aktivita ¹²⁵I se měří na gama-počítači 1 min. Koncentrace BNP v kalibrátorech a vzorcích je přímo úměrná změřené radioaktivitě. Kalibrační křivka se sestrojí na základě stanovení sedmi sérových kalibrátorů a hodnoty BNP přítomného ve vzorcích se odečtou z této křivky. Stanovení se provádí za laboratorní teploty. Rozsah stanovení je 2 – 2000 ng/l (vyšší koncentrace BNP se ředí diluentem). Analytická citlivost je 2 ng/l. Preciznost v sérii 2,0 – 2,7 %, mezi sériemi 2,1 – 4,2 %; linearita ředění je 80 – 110 %.

ELISA je založena na kompetitivním principu, kdy na králičí protilátku (vázanou na mikrotitrační destičce) se naváže specifická protilátka vůči BNP (1,5 h třepání). Po čtyřnásobném promytí nastává kompetice o její vazebná místa mezi peptidem ze vzorku a biotinylovaným peptidem (2,5 h třepání). Po čtyřnásobném promytí dochází k navázání konjugátu streptavidinu s křenovou peroxidázou (45 min třepání). Po čtyřnásobném promytí se přidá substrát tetrametylbenzidin a barevná změna reakce s peroxidázou (30 min třepání ve tmě) se sleduje ihned po zastavení stop činidlem (0,2 M H₂SO₄) fotometricky při 450 nm. Analýza probíhá při laboratorní teplotě. Mez detekce: 1,02 ng/l. Rozsah měření je na základě šestibodové kalibrace 0,1 – 1000 ng/l. Signál je nepřímo úměrný koncentraci BNP ve vzorku. Preciznost v sérii byla CV < 10 %, mezi sériemi < 15 %.

Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) probíhá tak, že se do reakční nádobky dávkuje vzorek a poté latexové mikročástice potažené myší monoklonální protilátkou vůči BNP a pufr. Po inkubaci se reakční směs přenese na fritu a nenavázaný materiál se oddělí promytím. Přidá se druhá myší monoklonální protilátka vůči BNP značená ALP. Po inkubaci a promytí se dávkuje substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí na fluoreskující umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky. Šestibodová kalibrace je v rozsahu 15 – 4000 pg/l. Vzorky s koncentrací BNP > 4000 pg/l se ředí automaticky 5x (do 20000 pg/l). Preciznost v sérii je 4,3 – 6,3 %, celková preciznost metody je 6,5 – 9,4 %; linearita ředění 94 – 112 %. Senzitivita je 15 pg/l (2 SD nulového blanku). Při koncentraci 15000 pg/l nebyl zaznamenán detekovatelný přenos. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým stanovením. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší.

Chemiluminiscenční analýza - stanovení je založeno na nekompetitivní (sendvičové) imunochemické reakci s detekcí záblesku vzniklého chemiluminiscenční reakcí. BNP ze vzorku se během inkubace (6,3 min, 37 °C) váže na monoklonální myší protilátku F(ab´)₂ (specifickou vůči cirkulární struktuře BNP), značenou esterem akridinu. Následně se přidává druhá monoklonální myší protilátka (specifická k C-terminální oblasti BNP), která je kovalentně přes streptavidin-biotinový můstek navázaná na paramagnetické částice niklu (inkubace 3 min, 37 °C). Po odstranění nezreagovaného materiálu odsátím a promytím se přidá alkalizovaný peroxid vodíku, který vyvolá chemiluminiscenční záblesk detekovaný luminometrem. Intenzita záření je přímo úměrná koncentraci BNP ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě sedmibodové základní kalibrace při použití nových šarží činidel a dvoubodové rekalibrace po dvou nejpozději však čtyřech týdnech. Linearita metody je 2 – 5000 ng/l. Vzorky s koncentrací BNP vyšší než 5000 ng/l se ředí univerzálním diluentem. Používané automatické ředění je 1+1, další ředění lze provést manuálně. Analytická citlivost metody je 2 ng/l, funkční citlivost 2,5 ng/l. Preciznost v sérii je 1,9 – 2,7 %, mezi sériemi 2,9 – 3,3 %. Zpětný výtěžek:  90,6 – 97,4 %, linearita ředění: 84,4 – 93,4 %. Efekt nadbytku antigenu se do 100000 ng/l neprojevuje. Při metodě neruší: hemoglobin do koncentrace 10 g/l, triacylglyceroly do koncentrace 9 mmol/l, bilirubin do koncentrace 427µmol/l (interference ≤ 10 %).

Jiná chemiluminiscenční imunoanalýza v sendvičovém uspořádání používá myší monoklonální protilátku vůči BNP, zakotvenou na paramagnetických částicích ke které se přidává ředěný standard nebo vzorek. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá myší monoklonální protilátka vůči BNP značená akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je přímo úměrná koncentraci BNP a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Metoda dovoluje na základě šestibodové kalibrace měřit vzorky v rozmezí koncentrací 10 – 5000 ng/l (vyšší koncentrace se ředí automaticky 5x). Preciznost v sérii 0,9 – 5,6 %, celkově 1,7 – 6,7 %. Linearita ředění je 77 – 102 %. Analytická senzitivita (2 SD nulového blanku) je 10 ng/l. Při koncentraci 25000 ng/l nebyl zaznamenán detekovatelný přenos. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze. Měření je třeba provést (pokud se podává) před podáním nebo 2 h po podání Natrecoru (rekombinantní BNP).

Kromě uvedených komerčních postupů existuje také nekomerční chemiluminiscenční metoda, kdy se na mikrotitrační destičku potaženou streptavidinem uchytí biotinylovaná protilátka BC203 (jak vůči BNP, tak proBNP). Po imunoreakci s BNP a promytí se z druhé strany BNP naváže protilátka KY-BNP-II, specifická vůči cirkulární struktuře BNP, značená ALP. Po promytí se přidá substrát: dvojsodná sůl 2-chlor-5-(4-metoxy-spiro{1,2-dioxetan-3,29-(59-chlor)-tricyclo

[3,3,1,13,7]dekan}-4-yl)-1-fenylfosfátu. Signál luminiscence sledovaný vertikálním luminometrem je přímo úměrný koncentraci BNP. Rozsah měření metody je pouze do 865 ng/l.

Senzitivita stanovení BNP 97% při specifitě 84%.

Hodnoty snižuje: hemodialýza, účinná léčba srdečního selhání.

Hodnoty zvyšuje: morfin (léčba plicního otoku), věk (malý vzestup), hypovolemie, nadměrná tělesná aktivita.