chlamydia trachomatis antibodies IgA

Sérum je stabilní 1 d za laboratorní teploty, 7 d při 2 – 8 °C, 1 rok při -20 °C.

ELISA probíhá tak, že protilátky specifické vůči chlamydiím obsažené v testovaném vzorku se vážou na purifikovaný antigen Chlamydia trachomatis v reakčních jamkách testovací destičky (inkubace 60 min jiná metoda 30 min při 37 °C). Po promytí (3x) se konjugát králičí protilátky vůči lidskému IgA  s křenovou peroxidázou váže na protilátky vůči chlamydiím (inkubace 30 min při 20 – 25 °C). Po promytí (3x) probíhá rekce tetrametylbenzidinu s enzymovou částí konjugátu. Tato reakce je po 15 min ve tmě (při 20 – 25 °C) zastavena přidáním zastavovacího roztoku (0,2 M H₂SO₄). Žluté zbarvení, které vzniká, se hodnotí fotometricky při 450/650 nm do 30 min. Množství navázaného konjugátu, a tedy rovněž intenzita barvy v jamkách, jsou přímo úměrné koncentraci protilátek ve vzorku. Průměrná hodnota kalibrátoru v dubletu je cutoff. Výsledky s absorbancí < cutoff – 15 % jsou negativní, cutoff – 15 % až < cutoff + 15 % jsou neurčité a ≥ cutoff + 15 % jsou pozitivní. Preciznost v sérii je 4,7 %, mezi sériemi 7,1 %. Relativní senzitivita je > 95 %, relativní specifita 97,3 %. Hemolytické, lipemické nebo ikterické sérum nemá žádný vliv při koncentraci hemoglobinu 10 g/l, triacylglycerolů 5,65 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l.

ELISA může také používat v konjugátu kozí polyklonální protilátky proti lidským imunoglobulinům (G, A, M) označené ALP. V tom případě se používá jako substrát p-nitrofenylfosfát a stop činidlo je 1,2 M NaOH. Inkubace jsou 60 + 30 + 30 min při 37 °C, mezi inkubacemi promývání 4x a měření při 405/620-690 nm do 1 h.

Nepřímá fluorescence je mikroskopická metoda. Fluorescenční imunoanalýza používá 3x7 jamek potažených antigeny C. pneumoniae, C. trachomatis, a C. psittaci. Po pipetování vzorku obsahujícího protilátky vůči chlamydiím proběhne první inkubace 30 min při 37 °C. Po promytí probíhá 30 min při 37 °C reakce s konjugátem, tj. králičí protilátkou (specifická k α-řetězci) vůči lidskému IgA značenou fluorescein izotiokyanátem. Pak probíhá odečítání ve fluorescenčním mikroskopu.

Semikvantitativní stanovení specifických protilátek IgA vůči Chlamydia trachomatis je založeno na nepřímé chemiluminiscenční imunoanalýze (CLIA). Ke vzorku se přidají biotinylované syntetické peptidy specifické pro Chlamydia trachomatis a magnetické částice potažené streptavidinem. Po inkubaci a promytí se přidá myší monoklonální protilátka vůči lidskému IgA, která je značená izoluminolem. Po inkubaci a promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je přímo úměrná hladině IgA protilátek, celá analýza trvá 30 min; dva kalibrátory adjustují vzorovou kalibrační křivku a určí se cutoff. Vzorky s koncentrací protilátek IgA < 5 kU/l se považují za negativní, 5 – 6 kU/l jsou neprůkazné a ≥ 6 kU/l jsou pozitivní na protilátky IgA Rozsah testu je 3 – 250 kU/l. Preciznost v sérii 3,0 – 6,5 %, mezi sériemi 4,9 – 12,1 %. Relativní senzitivita je 91,6 %, relativní specificita 93,5 %. Hemolytické, lipemické nebo ikterické sérum nemá žádný vliv při koncentraci hemoglobinu 10 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l. Aby byla zajištěna spolehlivá interpretace výsledků, musí být provedeno stanovení protilátek IgG i IgA.

Western blot používá rekombinantní fúzní proteiny chlamydií (Chlamydia trachomatis), které jsou rozděleny na polyakrylamidovém gelu s 13 % laurylsíranem sodným. Obsah gelu je pak převeden elektroblotem na nitrocelulózovou membránu. Správná exprese a velikost fúzních proteinů je potvrzena monoklonální protilátkou vůči hexahistidinu nebo kozím antisérem vůči glutation-S-transferáze a pak následuje reakce s druhou protilátkou kozí vůči myšímu IgG nebo králičí vůči kozímu IgG konjugovanou s křenovou peroxidázou. Detekce protilátek ze séra a rekombinantních fúzních proteinů jsou provedeny 0,1 µg čištěného proteinu na každý proužek, při ředění séra 1+200. Lidské imunoglobuliny IgG a IgA jsou prokázány druhou protilátkou (ředění 1+1000) konjugovanou s křenovou peroxidázou. Signál je detekován zesílenou chemiluminiscencí.

Falešná negativita: při účinné léčbě (chinolóny, Azitromycin, Josamycin, aj.), chybně připravené vzorky.

Falešná pozitivita: křížová reaktivita (Acinobacter species, Neisseria gonorrhoeae, streptokoky skupiny B).