ECP, eosinophil cationic protein; cytotoxic ribonuclease, ribonuclease 3, RNS3, RNase 3

Odběr nemusí být nalačno. Stanovení se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans EDTA nebo heparin). Je třeba vyloučit hemolýzu. Separaci séra nebo plazmy provést do 2 h od odběru. Výsledky v plazmě jsou nižší než v séru. Stabilita v séru nebo plazmě 24 h při 15 – 25 °C, 3 – 7 d při 2 – 8 °C, 3 – 6 měsíců při -20 °C. Opakované rozmrazení se nedoporučuje. K zamrazení nepoužívat skleněné zkumavky.

RIA v kompetitivním uspořádání je založeno na soutěži ECP a ECP-¹²⁵I o vazebná místa na protilátce vůči lidskému ECP. Inkubace probíhá 3 h za laboratorní teploty. Pak se přidá druhá (precipitační) protilátka a 30 min za laboratorní teploty probíhá srážení. Po odstředění v chlazené centrifuze se supernatant odstraní a radioaktivita precipitátu se měří 1 min gama-počítačem. Signál je nepřímo úměrný koncentraci ECP a kvantifikuje se na základě kalibrační křivky.

ELISA je založena na sendvičovém principu, kdy na protilátku vůči ECP (vázanou na mikrotitrační destičce) se naváže ECP ze vzorku (inkubace 2 h, třepání). Po čtyřnásobném promytí se připojí k jinému místu ECP druhá biotinylovaná protilátka vůči ECP (inkubace 2 h, třepání). Po čtyřnásobném promytí se přidá konjugát streptavidinu s křenovou peroxidázou (inkubace 1 h za tmy, třepání). Po čtyřnásobném promytí se přidá substrát tetrametylbenzidin a barevná změna reakce s peroxidázou (6 - 9 min za tmy) se sleduje do 15 min po zastavení stop činidlem (0,5 M HCl) a protřepání fotometricky při 450 nm. Analýza probíhá při laboratorní teplotě. Mez detekce: 0,05 µg/l. Rozsah měření je na základě sedmibodové kalibrace 0,3 – 20 µg/l (vyšší koncentrace se ředí dilučním pufrem). Jiný postup má měřící rozsah 1,56 – 100 µg/l. Signál je přímo úměrný koncentraci ECP ve vzorku. Jiný postup dosahuje preciznost v sérii < 8 %, mezi sériemi < 10 %. Linearita ředění 91 – 108 %.

FEIA – vzorek je inkubován s myší monoklonální protilátkou vůči ECP, která je kovalentně vázaná na stěně zkumavky. Po promytí se přidá protilátka vůči ECP značená β-galaktosidázou. Následuje druhá inkubace a opětné promytí. Pak se přidá substrát 4-metylumbeliferyl- β-D-galaktosid a po zastavení reakce (4 % roztok Na₂CO₃) se měří fluorescence (excitace 367 nm, emise 445 nm), která je přímo úměrná množství ECP ve vzorku. Rozsah měření je na základě pětibodové kalibrace 2 – 200 µg/l (vyšší koncentrace se ředí dilučním pufrem). Mez detekce: 0,05 µg/l. Preciznost v sérii 4 – 6 %, mezi sériemi 4 – 5 %; zpětný výtěžek 87 %.

Chemiluminiscenční stanovení je založeno na sendvičové imunochemické reakci, kde je ALP jako marker. ECP se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váže jedním epitopem na monoklonální myší protilátku imobilizovanou na polystyrenové kuličce a druhým epitopem na králičí polyklonální myší protilátku konjugovanou s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se ihned rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření je přímo úměrná koncentraci ECP ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Linearita metody je 0,2 – 200 µg/l. Analytická citlivost je 0,2 µg/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 1591 µg/l. Preciznost v sérii: 4,0 – 6,1 %, celková: 7,1 – 10,6 %. Zpětný výtěžek:  79 – 112 %, linearita ředění 78 – 104 %. Triacylglyceroly do 33,9 mmol/l a bilirubin do koncentrace 342 µmol/l neinterferují. Vyšetření v plazmě se nedoporučuje.

Hodnoty snižuje: přechovávání vzorku ve skleněných zkumavkách, inhalační steroidní léčba.

Hodnoty zvyšuje: tělesná zátěž (vzestup až o 100 %; normalizace do 45 min), transplantace jater (marker imunitní aktivace), pozdní separace séra, zvýšení eozinofilů, nedodržení doby koagulace (při použití srážlivé krve), vyšší teplota při koagulaci, hemolýza, heterofilní protilátky.