Popis vyšetření: LIPÁZA

Zařezeno v kategoriích:

Synonyma:

triacylglycerol acylhydrolasa, EC 3.1.1.3;
triacylglycerollipasa; lipáza; lipasa; jaterní lipasa; triglyceridlipasa; triglyceridasa;
post-heparin plazma protaminrezistentní lipasa; post-heparin lipasa rezistentní vůči soli ; heparinem uvolňovaná jaterní lipasa;
butyrinasa; tributyrasa; tributyrinasa; tributyrinesterasa;
GEH; glycerolesterhydrolasa; triacylglycerolesterhydrolasa;  triglyceridhydrolasa; trioleinhydrolasa;
jaterní monoacylglycerolacyltransferasa;
tweenasa; tweenhydrolasa; tweenesterasa; tween-hydrolyzující esterasa;
PPL; kakordasa; kapalasa L; lipazin; steapsin; triacetinasa;       
amano AP; amano B; amano CE; amano CES; amano P; amno N-AP; GA 56; Meito MY 30; Meito Sangyo OF lipasa; Takedo 1969-4-9;  

Chemické názvosloví připouští u enzymů pouze koncovku –asa, progresivní pravopis a řada současných lékařských publikací uvádí koncovku –áza. V češtině se odvozený název EC triacylglycerol lipase vyskytuje zcela ojediněle v jakékoliv variantě (jedno slovo, resp. samostatný kmen; koncovka -áza či -asa), v anglickém názvosloví EC je kmenový základ (např. lipase, hydrolase) vždy samostatně. Mezinárodní zkratka PPL (Google 253 000) je označení pro prasečí pankreatickou lipázu,  GEH = glycerolesterhydroláza  se příliš nepoužívá (Google 4 690). Frekventovanější je označení LPS (Google 51 000), někdy se používá  HPL = lidská pankreatická lipáza (Google 7 910).

Preanalytická fáze:

Při stanovení v séru je stabilita: 7 dnů při 20 - 25 °C, 7 – 21 dnů při 4 - 8 °C, 1 rok při -20 °C.
Nesmí se použít zkumavka s přídavkem EDTA; nestanovovat v plazmě. Plazma obsahuje kromě pankreatické lipázy také další enzymy s lipolytickou aktivitou: žaludeční, jazykovou a jaterní lipázu, intestinální lipázu
(z duodenální sliznice) a lipoproteinovou lipázu, EC 3.1.1.34. V plazmě se nachází také aliesteráza (karboxylesteráza, EC 3.1.1.1.), která štěpí estery glycerolu s krátkými mastnými kyselinami a arylesteráza
(EC 3.1.1.2) štěpící estery fenolu. Všechny tyto enzymy mohou interferovat při stanovení aktivity pankreatické lipázy při použití nedostatečně specifických metod.
Hemolýza ( hemoglobin ≥ 2,5 g/l) ruší stanovení; renální insuficience a opiáty zvyšují aktivitu lipázy. Je třeba se vyhnout opakovanému zamrazení vzorku.

Poznámky k analytické metodě:

Zásadní poznatek pro pochopení metodologie stanovení lipázy je to, že enzym působí pouze na rozhraní mezi esterem a vodou. Tedy substrát musí být ve formě emulze. Reakční rychlost stoupá, je-li emulze více dispergována – tedy plocha rozhraní je větší. Neschopnost získat vhodné rozhraní mezi esterem a vodou umožňuje, aby se uplatnily jiné enzymy jako karboxylová ester hydroláza, arylester hydroláza a lipoproteinová lipáza. Jsou-li používány triacylglycerolové substráty s krátkými řetězci mastných kyselin, které jsou ve vodě rozpustné, mohou se také uplatnit výše uvedené enzymy jako falešná lipázová reakce.

První titrační metody byly příliš zdlouhavé (24 h inkubace séra při 37 °C s 50 % emulzí olivového oleje a 5 % arabskou gumou ve fosfátovém pufru při pH 7,0; uvolněné mastné kyseliny byly titrovány 50 mmol/l NaOH na fenolftalein).
Detekce byla možná i za 1 h, jestliže se uvolněné mastné kyseliny extrahovaly (detekce na metylčerveň). Jedna z variant tohoto postupu je uvedena jako doporučená metoda.
Podstatně rychlejší je využití pH metru k detekci ukončení titrace (pH-stat); rozsah metody do 76,1 µkat/l, reprodukovatelnost v sérii CV 1,8 – 5,5 %, mezi dny 1,9 – 6,4 %.
Nebo se sleduje rychlost změny pH vlivem uvolněných mastných kyselin (detekce změny pH 0,02 – jako substrát je olivový olej a doba analýzy je 3 min).

Imunochemické metody stanovují lipázu buď kvantitativně (enzymová imunoanalýza) nebo semikvantitativně (latexová aglutinace), kdy je protilátka vázaná na latexové částice, které reagují se vzorkem.
Při nekompetitivní enzymové imunoanalýze (ELISA) jsou Fab fragmenty protilátky proti pankreatické lipáze kovalentně navázány na křenovou peroxidázu. V přítomnosti lipázy dochází k vazbě na kotvící specifickou protilátku a poté k vazbě konjugátu na lipázu. S tetrametylbenzidinem dochází k vývoji zbarvení, jehož nárůst je úměrný koncentraci lipázy ve vzorku. Vertikální fotometrie se provádí při 450 nm. Mez detekce je 0,017 µkat/l. Přesnost v sérii je CV 4,9 %, mezi sériemi 5 – 9 %.

Enzymová kaskáda používá 1,2-diglycerid mastné kyseliny s dlouhým řetězcem, rozpouštějící micely, obsažený ve vaječném lecitinu. Lipáza štěpí tento substrát na 2-monoglycerid a mastnou kyselinu. Reakční směs je pufrována na pH 6,8 (N-morfolino)etansulfonovou kyselinou/N,N-bis(2-hydroxyetyl)-2-aminoetansulfonovou kyselinou. V dalším kroku je 2-monoglycerid hydrolyzován na glycerol specifickou 2-monoglycerid lipázou a je pufrována na pH 8,0 3-[tris(hydroxymetyl)metylaminopropan-sulfonovou kyselinou. V posledním kroku je chromogen (4-aminofenazon/N-etyl-N-[2-hydroxy-3-sulfopropyl-m-toluidin] [TOOS]) oxidován na fialové barvivo s maximem absorbance 550 nm. Reakční směs také obsahuje kolipázu, deoxycholát a vápenaté ionty. Postup má dobrou reprodukovatelnost a je snadno automatizovatelný. Reprodukovatelnost v sérii byla CV 0,29 –
2,57 %, celková reprodukovatelnost 1,30 – 3,44 %.
Odlišný postup byl použit při technologii suchého filmu. Zde byl 1-oleyl-2,3-diacetoylglycerol adsorbovaný na částice oxidu titaničitého. Tyto částice poskytly povrch potřebný pro vznik aktivity lipázy. Pro zvýšení aktivity lipázy jsou také přítomny emulgátor a prasečí kolipáza. Lipáza působí na asymetrický triacylglycerol tak, že se uvolňuje kyselina olejová a diacetoylglycerol, který je rozpustný ve vodě. Diacetoylglycerol difunduje do další vrstvy filmu, kde esteráza odštěpí obě acetátové skupiny a uvolní se glycerol, který je pak kvantifikován enzymovou metodou. Když se nechá určitá prodleva před měřením, tak se endogenní glycerol (mohou jej obsahovat některá léčiva) spotřebuje a neinterferuje při analýze.
Při fotometrickém stanovení lze také pracovat pouze s jediným enzymem – pankreatickou lipázou, který hydrolyzuje v přítomnosti laurylsíranu sodného a fenylmetylsulfonylfluoridu 2,3-dimerkapto-1-propanol tributyrát na 2,3-dimerkapto-1-propanol a kyselinu máselnou. Uvolněný 2,3-dimerkapto-1-propanol reaguje
s 5,5´-dithiobis(2-nitrobenzoovou kyselinou) za vzniku žlutého thio-2-nitrobenzoátu, který se detekuje při
412 nm. Reprodukovatelnost v sérii CV < 5 %.
Jiný umělý substrát je ester 1,2-O-dilauryl-glycero-3-glutarová kyseliny a 4-metylresorufinu. Po štěpení lipázou vzniká nestabilní ester dikarboxylové kyseliny, který se spontánně hydrolyzuje na žlutou kyselinu glutarovou
a modro-purpurový 4-metylresorufin s absorpčním maximem 580 nm. Kinetika vzniku metylresorufinu je přímo úměrná aktivitě lipázy. K dosažení optimální reaktivity a specifity se přidávají soli žlučových kyselin, kolipáza
a chlorid vápenatý. Celková reprodukovatelnost stanovení je CV 5,7% až 9,6%.

Vyčeření je postup při kterém se sleduje snížení zákalu emulze oleje s vodou při 340 nebo 400 nm v důsledku hydrolýzy triacylglycerolů lipázou. Tato technika vyžaduje vysoce stabilní a reprodukovatelně připravovaný substrát, který má vhodnou počáteční absorbanci. Vzorek se přidá k substrátu a kinetika vyčeření se měří turbidimetricky nebo nefelometricky. Kolipáza zvyšuje reakční rychlost a spolu s přídavkem žlučových kyselin zvyšuje spolehlivost analýzy. Metoda je rychlá a snadno automatizovatelná. Koncentrace substrátu je ovšem daleko pod úrovni konstanty Michaelise a Mentenové a proto nebyl tento postup navržen ke standardizaci. Vysoké hodnoty revmatoidního faktoru ruší stanovení. Mez detekce 0,09 µkat/l. Rozsah metody do 4,7 µkat/l. Reprodukovatelnost v sérii CV 9,3 – 10,9 %, mezi sériemi 13 – 14 %.

Fluorimetrická detekce je založena na hydrolýze esteru kyseliny olejové se 4-metyl-umbeliferonem prostřednictvím lipázy. Uvolněný 4-metylumbeliferon se detekuje fluorimetrem. Reprodukovatelnost měření
CV 6,2 – 15,5 %; výtěžnost 98 – 102 %.

Nový typ techniky stanovení pankreatické lipázy je založen na změně vodivosti roztoku uvolněním mastných kyselin ze substrátu-trioleinu; detekce se provádí akustickým snímačem a měřenou veličinou je frekvenční odpověď.

Intraindivuduální variace 14 %, interindividuální variace 17 %.
Senzitivita 98,1 %, specificita 81 %.

Referenční metoda nebyla ustanovena.
V roce 2003 byly připraveny dva certifikované referenční materiály a to z lidské pankreatické šeávy pod označením BCR 693 (Bureau Communitaire de Référence) a rekombinantní technologii pod označením BCR 694. Oba materiály mají stejné katalytické vlastnosti a stabilitu.

Toleranční limit EHK: 24 %.

Významné interference:

Výsledky stanovení lipázy zvyšují: acetaminofen, albumin, betanechol, bilirubin, cerivastatin, deoxycholát, diazoxid, didanosin, dideoxyinosin, dipidolor, estropipat, etanol, felbamat, fentanyl, hemodialýza, heparin, hydrokortizon, chlorothiazid, cholinergika, kalcitriol, klozapin, kodein, kyselina valproová, meperidin, merkaptopurin, metacholin, metolazon, metronidazol, minocyklin, morfin, nitrofurantoin, orální kontraceptiva, pegaspargasa, pentazocin, peritoneální dialýza, prednisolon, sekretin, spasmoveralgin, sulfamethoxazol, aj.
Výsledky stanovení lipázy snižují: citronan, EDTA, hemoglobin, oxalát, revmatoidní faktor (turbidimetrie, nefelometrie), těhotenství, aj.