Parvovirus B19 antibodies, Parvo B19 Abs, anti-B19 IgG antibodies, anti-B19 IgM antibodies

Odebírá se venózní srážlivá krev ráno nalačno. Lze odebrat i do heparinu nebo EDTA. Nutný je odběr dvou vzorků v intervalu do 30 dnů. Je třeba vyloučit hemolýzu a chylozitu. Stabilita v séru je při 15 – 25 °C 2 d, při 4 – 8 °C 5 d, při -20 °C 1 rok. Opakované rozmrazení se nedoporučuje.

Všechny metody jsou kvalitativní nebo semikvantitativní.

RIA má pro toto stanovení již jen historický význam. Postup byl zdlouhavý. Na polystyrénové kuličky se nanesla protilátka vůči lidskému IgG (metoda GACRIA) nebo IgM (metoda MACRIA). Inkubace za laboratorní teploty 1 h. Protilátka na kuličkách reagovala s analyzovaným sérem 3 h při 37 °C. Po promytí kuliček se přidal virový supernatant (extrahovaný chloroformem) a směs se inkubovala přes noc za laboratorní teploty. Kuličky se propláchly a inkubovaly s myší monoklonální protilátkou vůči Parvoviru B19 3 h při 37 °C. Kuličky se opět propláchly a nechaly reagovat 90 min při 37 °C s ovčí protilátkou proti myšímu imunoglobulinu značenou ¹²⁵I. Po promytí se měřila radioaktivita precipitátu 5 min gama-počítačem a byla nepřímo úměrná množství protilátek (IgG nebo IgM).

Nepřímá imunofluorescence IgG Do jamek destiček s ukotveným antigenem (rekombinantní protein B19), blokovaným morčecím komplementem, byla pipetována analyzovaná séra (naředěná fosfátovým pufrem). Po inkubaci 30 min při 20 – 25 °C vypláchnutí a promývání (2x) byl přidán konjugát fluorescein izotiokyanátu s ovčí protilátkou vůči lidskému IgG. Následovala další inkubace 30 min při 20 – 25 °C. Pak byly vzorky promyty (2x), vysušeny a překryty glycerolovým médiem s fosfátovým pufrem (pH 8,4) a analyzovány ve fluorescenčním mikroskopu. Vzorky bez fluorescence jsou negativní, s titrem 1:16 nepřímé fluorescence (excitace 488 nm, emise 530 nm) na 1+ jsou nejasné a s titrem 1:16 a fluorescencí > 1 jsou pozitivní. Senzitivita: 97 %, specificita: 100 %.

Nepřímá imunofluorescence IgM Pro průkaz IgM protilátek je třeba sérum upravit reakcí se sorbentem (kozí protilátkou vůči lidskému IgG). Do jamek destiček s ukotveným antigenem (rekombinantní protein B19), blokovaným morčecím komplementem, byla pipetována analyzovaná séra (naředěná fosfátovým pufrem). Po inkubaci 30 min při 20 – 25 °C vypláchnutí a promývání (2x) byl přidán konjugát fluorescein izotiokyanátu s ovčí protilátkou vůči lidskému IgM. Následovala další inkubace 30 min při 20 – 25 °C. Pak byly vzorky promyty (2x), vysušeny a překryty glycerolovým médiem s fosfátovým pufrem (pH 8,4) a analyzovány ve fluorescenčním mikroskopu. Vzorky bez fluorescence jsou negativní, s titrem 1:16 nepřímé fluorescence (excitace 488 nm, emise 530 nm) na 1+ jsou nejasné a s titrem 1:16 a fluorescencí > 1 jsou pozitivní. Senzitivita: 97 %, specificita: 100 %.

ELISA IgG umožňuje in vitro semikvantitativní vyšetření na protilátky třídy IgG vůči antigenům Parvoviru B19 v séru nebo plazmě. Reakční jamky mikrotitračních destiček jsou potažené antigenem Parvoviru B19. V prvním kroku reakce jsou zředěné vzorky sér inkubovány v jamkách 60 min při 37 °C. V případě pozitivního vzorku se specifické IgG protilátky (také IgM) váží k antigenům. Po promytí pufrem (3x) se k detekci navázaných protilátek provádí následně inkubace 30 min za laboratorní teploty ve tmě s enzymovým konjugátem (králičí protilátka vůči lidskému IgG značená peroxidázou), který je schopen vyvolat barevnou reakci, následně po promytí pufrem (3x), s přidaným tetrametylbenzidinem a H₂O₂. Po 15 min ve tmě se reakce zastaví 0,2 M H₂SO₄ a intenzita vzniklého zabarvení je přímo úměrná koncentraci IgG protilátek vůči antigenům Parvoviru B19. Měření se provádí při 450/620 nm do 30 min. Vysoce pozitivní vzorky mohou tvořit precipitát, proto se ředí fosfátovým pufrem a celý postup se u nich opakuje. Semikvantitativní výsledky jsou hodnoceny v poměru k absorbanci cutoff kalibrátoru tak, že výsledky < 0,9 jsou negativní; 0,9 až 1,1 jsou hraniční a > 1,1 jsou pozitivní. Přesnost v sérii 6,9 %, mezi sériemi 6,4 %. Senzitivita: > 95 %, specifita: > 95 %. Hemolytické, lipemické a ikterické vzorky nevykazují žádné interference do koncentrací 10 g Hb/l, 5,6 mmol/l TAG a 342 µmol/l bilirubinu.

ELISA IgM umožňuje in vitro semikvantitativní vyšetření na protilátky třídy IgM vůči Parvoviru B19 v séru nebo plazmě. Reakční jamky mikrotitračních destiček jsou potažené antigenem Parvoviru B19. V prvním kroku reakce jsou zředěné vzorky sér inkubovány v jamkách 60 min při 37 °C. V případě pozitivního vzorku se specifické IgM protilátky (také IgG) váží k antigenům. Po promytí pufrem (3x) se k detekci navázaných protilátek provádí následně inkubace 30 min za laboratorní teploty ve tmě s enzymovým konjugátem (protilátka vůči lidskému IgM značená peroxidázou), který je schopen vyvolat barevnou reakci, následně po promytí pufrem (3x), s přidaným tetrametylbenzidinem a H₂O₂. Po 15 min ve tmě se reakce zastaví 0,2 M H₂SO₄ a intenzita vzniklého zabarvení je přímo úměrná koncentraci IgG protilátek vůči antigenům Parvoviru B19. Měření se provádí při 450/620 nm do 30 min. Vysoce pozitivní vzorky mohou tvořit precipitát, proto se ředí fosfátovým pufrem a celý postup se u nich opakuje. Semikvantitativní výsledky jsou hodnoceny v poměru k absorbanci cutoff kalibrátoru tak, že výsledky < 0,9 jsou negativní; 0,9 až 1,1 jsou hraniční a > 1,1 jsou pozitivní. Přesnost v sérii 2,4 %, mezi sériemi 3,6 %. Senzitivita: > 95 %, specifita: > 95 %. Hemolytické, lipemické a ikterické vzorky nevykazují žádné interference do koncentrací 10 g Hb/l, 5,6 mmol/l TAG a 342 µmol/l bilirubinu.

Western blot Purifikovaný rekombinantní antigen NS1 Parvoviru B19 vázaný na SDS-PAGE byl přenesen elektroforeticky na nitrocelulózovou membránu. Nitrocelulóza byla pak blokována po dobu 60 min v 3 % želatině, promyta ve fyziologickém roztoku s TRIS pufrem a Tween detergentem. Nitrocelulózové archy byly rozřezány na 4 mm proužky. Na každý proužek byl nanesen ředěný vzorek séra v 1 % želatině ve fyziologickém roztoku s TRIS pufrem a Tween detergentem a proužek byl inkubován přes noc za laboratorní teploty. Po dvojnásobném promytí fyziologickým roztokem s TRIS pufrem a Tween detergentem byla nanesena na membránu králičí protilátka vůči lidskému IgG konjugovaná s křenovou peroxidázou a proběhla inkubace 2 h za laboratorní teploty. Komplex protilátky s konjugátem byl vybarvený 4-chlor-1-naftolem. Pozitivní výsledek byl prokázán přítomností pruhu v pozici odpovídající NS1 proteinu potvrzené pozitivní kontrolou NS1antigenu Parvoviru B19 hyperimunizovaného králíka.       

Pacienti s potlačenou imunitou nemusí vytvářet protilátky vůči Parvoviru B19. Jestliže sérum obsahuje IgM proti viru zarděnek, může se objevit křížová reakce při stanovení protilátek vůči Parvoviru B19.