Anti-CMV Antibodies-IgG; Cytomegalovirus antibodies – IgG; CMV Antibodies, IgG; CMV IgG.  

Stanovení se provádí v séru, není-li jiná možnost tak plazmě (antikoagulans EDTA, heparin nebo citrát). Následný vzorek do 1 měsíce. Stabilita v séru při laboratorní teplotě 1 d, při 4 – 8 °C 7 – 14 d, při -20°C 1 rok. Opakované rozmrazení se nedoporučuje.

Latexový test na principu pasivní aglutinace je kvalitativní (bez ředění), resp. kvantitativní (při sledování ředění dvojkové řady) test na proužku k průkazu CMV IgG + CMV IgM. Latexové částice potažené CMV antigeny AD169 aglutinují v přítomnosti protilátek vůči CMV. Výsledek se odečítá za 8 min pod lampou. Relativní senzitivita je 99 %, relativní specificita 97 %.

Komplement fixační test je reakce CMV antigenu soupravy s protilátkou ze vzorku, která je prokazována fixací (spotřebou) komplementu. Indikací fixace je hemolýza. Hemolytický systém tvoří ovčí erytrocyty a protilátky vůči ovčím erytrocytům (amboreceptory). Jestliže neprobíhá reakce mezi antigenem a protilátkou, protože se CMV protilátky v séru pacienta nenacházejí, komplement se nespotřebuje a je dostupný pro indikační reakci. Reakce antigenu s protilátkou indikačního systému vede k lýze ovčích erytrocytů (hemolýze) působením komplementu. Imunoreakce probíhá v mikrotitračních destičkách při 2 – 8 °C 15 – 24 h. Pak se přidá hemolytický systém a inkubuje se 15 – 30 min při 37 °C. Výsledky se odečítají vizuálně. Tento semikvantitativní postup nerozlišuje mezi CMV IgG a CMV IgM.

IRMA využívala polystyrénové kuličky potažené CMV. Po reakci s CMV IgG se připojila protilátka vůči lidskému IgG značená ¹²⁵I. Po inkubaci se supernatant odsál a zkumavky se 3x promyly. Navázaná aktivita se změřila gama-počítačem (1 min). Souprava už není na trhu.

ELISA používá mikrotitrační destičky se zakotveným CMV. Pipetuje se kalibrátor nebo vzorek a po inkubaci (60 min, 37 °C) se roztok odsaje a jamky 4x promyjí. Pak se přidá F(ab)  fragment králičí protilátky vůči lidskému IgG označený křenovou peroxidázou. Imunoreakce se provádí 60 min při 37 °C, roztok se odsaje a jamky 4x promyjí. Dále se přidává tetrametylbenzidin (inkubace 30 min ve tmě při 18 – 25 °C) a následně stop činidlo. Měření se provádí při 450/615-690 nm do 60 min. Používá se indexový kalibrátor CMV IgG (vzorky nelze ředit). Vzorky s indexem < 0,1 jsou negativní, ≥ 0,1 až ≤ 0,2 hraniční, > 0,200 jsou pozitivní. Preciznost v sérii 3,7 – 20,1 %, mezi sériemi 6,6 – 19,9 %. Zpětný výtěžek 85,8 – 114,1 %, linearita ředění 95,2 – 113,8 %. Hemolýza, lipémie a ikterus neruší. Relativní senzitivita je 99,3 %, relativní specificita 98,2 %.

K dispozici je také ELISA souprava pro IgG+IgM CMV. Používá mikrotitrační destičky se zakotveným CMV. Pipetuje se kalibrátor nebo vzorek a po inkubaci (30 min, 37 °C) se roztok odsaje a jamky 4x promyjí. Přidá se směs konjugátů králičí protilátky vůči lidskému IgG/POD (specifický pro γ-řetězec) a kozí protilátky vůči lidskému IgM/POD (specifický pro μ-řetězec). Imunoreakce se provádí se 30 min při 37 °C, roztok se odsaje a jamky 4x promyjí. Dále se přidává tetrametylbenzidin (inkubace 30 min ve tmě při 18 – 25 °C) a následně stop činidlo (0,25 M H₂SO₄). Měření se provádí při 450/615-690 nm do 60 min. Používá se indexový kalibrátor CMV IgG+IgM (vzorky nelze ředit). Vzorky s indexem ≤ 0,15 jsou negativní, > 0,1 až < 0,5 hraniční, ≥ 0,5 jsou pozitivní. Preciznost v sérii 5,1 – 22,1 %, mezi sériemi 8,4 – 31,8 %. Hemolýza, lipémie a ikterus neruší. Relativní senzitivita je 99 %, relativní specificita 98,2 %.

Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) probíhá tak, že se do reakční nádobky dávkuje vzorek ředěný TRIS pufrem a poté latexové mikročástice potažené cytomegalovirem AD169. Po inkubaci se reakční směs přenese na fritu a nenavázaný materiál se oddělí promytím. Přidá se kozí protilátka vůči lidskému IgG značená ALP v pufru TRIS. Po inkubaci a promytí se dávkuje substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí na fluoreskující umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky. Šestibodová kalibrace je v rozsahu 0,3 – 250 kU/l (vzorky s hodnotami CMV IgG > 250 kU/l lze automaticky ředit 10x). Preciznost v sérii je 5,8 – 8,7 %, celková preciznost metody je 9,7 – 15,7 %. Relativní senzitivita je 99,5 %, relativní specificita 100 %.

Chemiluminiscenční analýza v sendvičovém uspořádání používá virový lyzát cytomegaloviru AD169 zakotvený na paramagnetických částicích, ke kterému se přidává ředěný standard nebo vzorek. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá myší protilátka vůči lidskému IgG značená akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je přímo úměrná hladině CMV IgG a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Metoda dovoluje měřit vzorky na základě šestibodové kalibrace v rozmezí hodnot 0,2 – 250 kU/l (vzorky s hodnotami CMV IgG > 250 kU/l lze automaticky ředit 10x). Preciznost v sérii je 4,39 – 5,67 %, celkově 4,87 – 6,17 %. Relativní senzitivita je 99,34 %, relativní specificita 98,34 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu 5 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší.

CLIA (nepřímá chemiluminiscenční analýza) je další dvojstupňový zábleskový postup, kdy se na magnetické částice potažené antigenem CMV AD169 naváže během první inkubace (10 min) CMV IgG ze vzorku a po promytí se na její další epitop připojí během další inkubace (10 min) monoklonální myší protilátka vůči lidskému IgG značená izoluminolem. Po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu přímo úměrná hladině CMV IgG. Rozsah měření je na základě dvoubodové rekalibrace vzorové křivky (zadané čárovým kódem) 0 – 22 kU/l (při vyšších hodnotách ředit diluentem 20x). Analytická citlivost je 0,15 kU/l. Preciznost v sérii 2,7 – 8,9 %, mezi sériemi 5,5 – 10,6 %. Linearita ředění je 98,9 – 118,4 %. Relativní senzitivita je 99,88 %, relativní specificita 99,65 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu 10 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší.

Jiné stanovení je založeno na sendvičové imunochemické reakci se sledováním luminiscence zesílené enzymem. Protilátky vůči CMV se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váží na částečně purifikovaný CMV kmene AD169 imobilizovaný na polystyrénové kuličce. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytím se na druhé vazebné místo anti-CMV naváže monoklonální myší protilátka vůči lidskému IgG konjugovaná s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření 425 – 500 nm je přímo úměrná koncentraci CMV IgG ve vyšetřovaném vzorku. Používá se indexový kalibrátor CMV IgG (vzorky lze dle potřeby ředit manuálně). Vzorky s indexem < 0,9 jsou nereaktivní, 0,9 až < 1,1 jsou neurčité, ≥ 1,1 jsou reaktivní. Preciznost v sérii je 4,0 – 10,7 %, mezi sériemi 5,3 – 16,9 %. Relativní senzitivita je 99,2 %, relativní specificita 98,7 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu 5,4 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší.

Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530 v dvoustupňové reakci a sendvičovém uspořádání. Do zkumavky se pipetuje standard nebo vzorek obsahující CMV IgG, paramagnetické částice potažené inaktivním CMV antigenem. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Přidá se monoklonální myší protilátka vůči lidskému IgG značená ALP. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je přímo úměrné množství CMV IgG. Rozsah měření při 470 nm na základě šestibodové kalibrace je 7 – 400 kU/l (vyšší koncentrace protilátek vyžadují ředění). Doba analýzy činí 35 min. Preciznost v sérii je 8,2 – 10,5 %, mezi sériemi 8,6 – 10,6 %. Linearita ředění je 80,2 – 113,7 %. Analytická citlivost je 7 kU/l. Vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů ruší při analýze.

Chemiluminiscenční analýza v sendvičovém provedení, kdy CMV IgG ze vzorku se váže na antigen CMV, kterým jsou potaženy jamky mikrotitrační destičky. Po inkubaci (24 min, 37 °C) se promytím odstraní volný materiál a přidá se myší monoklonální protilátka vůči lidskému IgG značená křenovou peroxidázou. Po inkubaci (10 min, 37 °C) se promytím odstraní volný materiál a přidá se luminogen (derivát luminolu + sůl peroxykyseliny) jehož oxidaci katalyzuje POD za vzniku světla. Činidlo pro přenos elektronů (substituovaný acetanilid) zvyšuje hladinu uvolněného světla a prodlužuje jeho emisi. Signál na základě dvoubodové kalibrace vzorové křivky (čtyřparametrová logistická křivka) je přímo úměrný koncentraci CMV IgG ve vzorku. Rozsah měření 1,62 – 450 kU/l (vyšší koncentrace CMV IgG jsou automaticky ředěné 20x). Analytická senzitivita 1,62 kU/l. Preciznost v sérii 1,6 – 3,8 %, mezi sériemi je 2,3 – 13,6 %.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (20 µl) je inkubován biotinylovaným rekombinantním (E. coli) CMV antigenem a CMV rekombinantním antigenem (E. coli) značeným ruthéniovým komplexem. Pak se přidají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem, na který se naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Luminiscence je přímo úměrná hladině CMV IgG ve vzorku. Metoda je použitelná v rozsahu 0,25 – 5000 kU/l. Ředění při vyšších koncentracích 20x dovoluje měření do 10000 kU/l (koncentrace po ředění musí být > 15 kU/l). Analytická citlivost (2 SD nulového kalibrátoru) je 0,15 kU/l. Preciznost v sérii 0,8 – 2,7 %, mezi sériemi 3,2 – 4,5 %. Hemolýza, chylozita, ikterus a RF (< 1500 kIU/l) neruší. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměli odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu.

Hodnoty snižuje: oslabení imunity.

Hodnoty zvyšuje: hemolýza, chylozita, bakteriální kontaminace, antikoagulancia, heterofilní protilátky, zkřížená reaktivita s EBV IgM nebo RF.