anti-EBNA; anti-HHV-4 (EBNA), antibodies against human herpes virus 4

NA = nuclear antigen (jaderný)

Poznámka: nesprávně je Epstein-Barrové virus EBNA, protože EB ve zkratce znamená Epstein-Barr

Stanovení se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans EDTA). Stabilita v séru při 15 – 25 °C 4 – 24 h (3 d), při 4 – 8 °C 7 – 14 d, při -20 °C 3 – 12 měsíců.

ELISA metoda slouží pro kvantitativní/kvalitativní stanovení specifických IgG protilátek vůči jadernému antigenu viru Epstein-Barrové (syntetický peptid EBNA-1). Jamky mikrotitračních destiček jsou potaženy syntetickým peptidem EBNA-1. Po přidání vzorku nebo kalibrátoru se na EBNA-1 naváží specifické IgG protilátky (inkubace 60 min, 37 °C). Po promytí fosfátovým pufrem (5x) se, díky IgG protilátkám vůči EBNA-1 přítomným ve vyšetřovaném séru, konjugát (kozí protilátka vůči lidskému IgG spojená s křenovou peroxidázou) naváže na pevnou fázi (inkubace 60 min, 37 °C). Po promytí fosfátovým pufrem (5x) je enzymová aktivita po reakci s tetrametylbenzidinem a H₂O₂ (30 min, laboratorní teplota, ve tmě) úměrná koncentraci IgG protilátek vůči EBNA-1 ve vzorcích nebo v kalibrátorech. Výsledná intenzita zbarvení jamek se měří po přidání stop činidla (0,8 M H₂SO₄) do 60 min fotometrem při 450/630 nm nebo 405/630 nm a na základě čtyřbodové kalibrace je úměrná množství protilátek ve vzorku. Rozsah měření 5 – 200 kU/l. Preciznost v sérii 4,7 – 12,4 %, mezi sériemi 7,0 – 20,1 %; linearita ředění 98,0 – 100,4. Citlivost je 96,8 %, specifita 99,4 %. Lipemické (do 11,3 mmol/l triacylglycerolů), hemolytické (do 2,5 g/l hemoglobinu) a ikterické vzorky (do 513 µmol/l bilirubinu) neovlivňují výsledek testu.

ELISA IgG bez rozlišení EBV antigenu: IgG protilátky specifické vůči EBV, obsažené v testovaném vzorku, se vážou na antigen v reakčních jamkách mikrotitrační destičky (60 min, 37 °C). Po čtyřnásobném promytí se přidá konjugát fragmentu F(ab)´ králičí protilátky vůči lidskému IgG s navázanou křenovou peroxidázou se váže na tyto specifické protilátky (inkubace 60 min, 37 °C). Po čtyřnásobném promytí reaguje enzymová část konjugátu s chromogenem (tetrametylbenzidin) za vzniku modré zabarvení (30 min, 18 – 25 °C, tma).  Tato reakce je zastavena přidáním stop činidla, které způsobí žluté zbarvení. IgG proti buněčným antigenům jsou stejným způsobem detekovány v jamkách potažených kontrolním antigenem. Rozdíl v intenzitě barvy v jamce potažené specifickým antigenem a v jamce potažené kontrolním antigenem je měřítkem imunochemické reaktivity EBV-specifických IgG protilátek ve vzorku. Detekce se provádí při 450/615-690 nm do 60 min. Kvantitativní stanovení se vyhodnocuje v kU/l. Citlivost je 92 %, specifita 100 %. Lipemické, hemolytické a ikterické vzorky neovlivňují výsledek testu.

IFA je test určený k průkazu a semikvantitativnímu stanovení lidských protilátek vůči jádrovému antigenu EBV. Imunofluorescenční postup proti komplementu (anti-complement immunofluorescence ACIF) je třístupňová sendvičová imunoanalýza. V prvním kroku jsou séra s inaktivovaným komplementem přidána do jamek destiček, kde jsou inkubována se substrátem (EBV). Po inkubaci se promytím fosfátovým pufrem odstraní volné protilátky ze séra. V druhém kroku jsou antigeny v jamkách převrstveny morčecím komplementem. Fc fragment reaktivních pacientských protilátek reaktivních pacientských protilátek zahajuje sekvenci reakcí s proteiny komplementu (kaskádu komplementu) a označí počáteční reakce antigenu s protilátkou proteiny morčecího komplementu. Ve třetím kroku (vizualizace) se antigeny v jamkách překryjí fluoresceinem (FITC) značenou kozí protilátkou vůči třetí složce (C´3) morčecího komplementu. Po promytí a vysušení se jamky prohlížejí fluorescenčním mikroskopem (excitace 490 nm, emise 520 nm). Pozitivní reakce se objevuje u 20 – 30 % jamek jako fluorescence barvy světle zeleného jablka proti pozadí červeného kontrastního barviva negativních kontrolních jamek EBNA. Semikvantitativní hodnocení se provádí jako výsledný titr při postupném ředění pozitivních vzorků.

Chemiluminiscenční kvalitativní analýza v sendvičovém uspořádání používá antigen EBNA-1 zakotvený na paramagnetických částicích, ke kterému se přidává ředěný standard nebo vzorek. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá rekombinantní myší monoklonální protilátka vůči lidskému IgG značená akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je přímo úměrná hladině anti-EBNA-1 IgG a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Metoda dovoluje měřit vzorky na základě jednobodové kalibrace v tripletu (vzorky nelze ředit). Přítomnost nebo absence protilátek vůči EBNA-1 třídy IgG ve vzorku se určuje na základě porovnání hodnoty chemiluminiscenčního signálu v reakci s hodnotou cut-off, která je určena z kalibrační křivky. Je-li chemiluminiscenční signál vzorku vyšší nebo roven hodnotě cut-off, je vzorek považován za reaktivní na protilátky vůči EBNA-1 třídy IgG. Preciznost v sérii je 1,9 – 2,5 %, celkově 2,7 – 2,9 %. Relativní senzitivita je 99,5 %, relativní specificita 99,4 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu 5 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze in vitro.

CLIA (nepřímá chemiluminiscenční analýza) je další dvojstupňový zábleskový postup, kdy se na magnetické částice potažené syntetickým peptidem EBNA-1 naváží během první inkubace (10 min) protilátky vůči EBNA-1 ze vzorku. Po promytí se na jejich další epitop připojí během druhé inkubace (10 min) monoklonální myší protilátka vůči lidskému IgG značená izoluminolem. Po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu přímo úměrná hladině IgG protilátek vůči EBNA-1. Rozsah měření je na základě dvoubodové rekalibrace vzorové křivky (zadané čárovým kódem) 3 – 600 kU/l (při vyšších hodnotách ředit diluentem 20x). Analytická citlivost je 3 kU/l. Preciznost v sérii 2,5 – 11,3 %, mezi sériemi 3,4 – 11,8 %. Linearita ředění je 71 – 149 %. Relativní senzitivita je 99,8 %, relativní specificita 97,6 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu 10 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší.

Jiné stanovení je založeno na sendvičové imunochemické reakci se sledováním luminiscence zesílené enzymem. Protilátky vůči EBNA se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váží na EBNA antigen imobilizovaný na polystyrénové kuličce. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytím se na druhé vazebné místo protilátky vůči EBNA naváže monoklonální myší protilátka vůči lidskému IgG konjugovaná s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření 425 – 500 nm je přímo úměrná koncentraci anti-EBNA IgG ve vyšetřovaném vzorku. Používá se indexový kalibrátor anti-EBNA IgG (vzorky lze dle potřeby ředit manuálně). Vzorky s indexem < 0,9 jsou nereaktivní, 0,9 až < 1,1 jsou neurčité, ≥ 1,1 jsou reaktivní. Preciznost v sérii je 2,8 – 5,3 %, mezi sériemi 4,9 – 6,3 %. Relativní senzitivita je 85 %, relativní specificita 94 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu 5,4 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší.

WESTERNBLOT test umožňuje kvalitativní in-vitro stanovení lidských protilátek IgG vůči antigenům viru Epstein-Barrové. Test obsahuje proužky s elektroforeticky rozdělenými extrakty antigenů z EBV. Po 15 min inkubaci proužků v pufru (třepání) se v prvním reakčním kroku proužky blotu inkubují 30 min s ředěnými vzorky séra pacientů (třepání). V případě pozitivních vzorků, se specifické protilátky třídy IgG (také IgA a IgM) navážou na antigeny. Po trojnásobném promytí pufrem slouží k detekci navázaných protilátek druhá inkubace (30 min, třepání) provedená s kozí protilátkou proti lidským IgG značenou ALP (enzymový konjugát). Po trojnásobném promytí pufrem probíhá za třepání 10 min barevná reakce (substrát nitroblutetrazoliumchlorid/5-brom-4-chlor-3-indolylfosfát). Reakce se zastaví trojnásobným promytím deionizovanou nebo destilovanou vodou. Po vysušení proužků lze takto semikvantitativně hodnotit vedle sebe IgG protilátky VCA, EA i EBNA.

Falešně negativní hodnoty: u dětí předškolního věku, u imunodeficitních pacientů.

Falešně pozitivní hodnoty: křížová aktivita jiných herpetických virů, polyklonální aktivace B lymfocytů u imunopatologických stavů (mononukleóza).