nádorový antigen CA 19-9; Cancer Antigen 19-9, Carbohydrate Antigen 19-9;

Cancer associated CA 19-9; gastrointestinal tumor antigen; CA 19-9 protein, CA 19-9 native protein.

Stanovení se provádí v séru. Stanovit lze pouze u Lewis pozitivních (95 – 97 % populace). Stanovení v plazmě je rozporuplné (některé prameny varují před antikoagulanty). Ruší hemolýza a chylozita. Je třeba zabránit kontaminaci slinami. Doporučuje se včasná separace séra (do 2 h). Opakované zamrazení se nedoporučuje. Stabilita vzorku: 7 d při 20 – 25 °C, 7 – 30 d, při 4 – 8 °C, 3 – 12 měsíců při -20 °C.

IRMA je dvoukrokový sendvičový postup, který začíná pipetováním séra do zkumavek potažených monoklonální protilátkou vůči CA 19-9, pak následuje inkubace 2 h (třepání). Po inkubaci se supernatant odsaje a zkumavky se 2x promyjí. Pak se přidá druhá monoklonální protilátka vůči CA 19-9 značená ¹²⁵I. Po inkubaci (1 h, třepání) se supernatant odsaje a zkumavky se 2x promyjí. Navázaná aktivita se změří gama-počítačem (1 min). Celý postup se provádí za laboratorní teploty. Rozsah metody na základě šestibodové kalibrace je 2 – 480 kU/l; analytická citlivost 2 kU/l. Preciznost v sérii je ≤ 7,9 %, mezi sériemi ≤ 7,0 %; zpětný výtěžek 86 – 111 %, linearita ředění 88 – 113 %.  

Jiná IRMA používá zkumavky potažené streptavidinem a v prvním kroku se přidává protilátka 1116NS19-9 s biotinovou kotvou, na kterou se váže CA 19-9 ze vzorku. Následuje inkubace 1 h (třepání). Po inkubaci se supernatant odsaje a zkumavky se 2x promyjí. Pak se přidává protilátka 1116NS19-9 značená ¹²⁵I a opět se inkubuje 1 h (třepání). Po inkubaci se supernatant odsaje a zkumavky se 3x promyjí. Navázaná aktivita se změří gama-počítačem (1 min). Celý postup se provádí za laboratorní teploty. Rozsah metody na základě šestibodové kalibrace je 0,1 – 240 kU/l (vzorky > 240 kU/l se ředí 10x); analytická citlivost 0,1 kU/l. Preciznost v sérii je 2,0 – 8,5 %, mezi sériemi 5,4 – 15,6 %; zpětný výtěžek 86,7 – 101,1 %, linearita ředění průměrně 108 %. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 1500000 kU/l.   

ELISA používá mikrotitrační destičky se zakotvenou monoklonální protilátkou vůči CA 19-9. Pipetuje se kalibrátor nebo vzorek a po inkubaci (90 min, třepání, 37 °C) se roztok odsaje a jamky 4x promyjí. Pak se přidá druhá monoklonální protilátka proti CA 19-9 označená křenovou peroxidázou. Imunoreakce se provádí se 90 min (třepání, 37 °C), roztok se odsaje a jamky 4x promyjí. Dále se přidává tetrametylbenzidin (inkubace 20 min ve tmě za laboratorní teploty) a následně stop činidlo. Měření se provádí při 450 nm do 15 min na základě šestibodové kalibrace v rozmezí 10 – 600 kU/l (některé testy 0,2 – 240 kU/l). Preciznost v sérii 8,4 – 9,6 %, mezi sériemi 1,9 – 8,7 %. Zpětný výtěžek 85,5 – 98,5 %, linearita ředění 93,1 – 114,7 %. Hemolýza, lipémie a ikterus neruší. Analytická citlivost je 0,2 kU/l. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 3840 kU/l.

Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) probíhá tak, že se do reakční nádobky dávkuje vzorek ředěný TRIS pufrem a poté latexové mikročástice potažené myší monoklonální protilátkou vůči 1116-NS-19-9. Po inkubaci se reakční směs přenese na fritu a nenavázaný materiál se oddělí promytím. Přidá se myší monoklonální protilátka vůči 1116-NS-19-9 značená ALP v pufru TRIS. Po inkubaci a promytí se dávkuje substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí na fluoreskující umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky. Šestibodová kalibrace je v rozsahu 2 – 500 kU/l. (Vzorky s hodnotami CA 19-9 > 500 kU/l lze automaticky nebo manuálně ředit; při automatickém ředění systém vzorek naředí 10x – hodnota po ředění musí být > 30 kU/l a po vynásobení do 5000 kU/l). Preciznost v sérii je 3,7 – 11,4 %, celková preciznost metody je 6,2 – 19,1 %; zpětný výtěžek 96 – 105 %. Analytická senzitivita je 2 kU/l.

Zesílená fluorescence rozložená v čase je označována jako TRACE (time resolved amplified cryptate emission), kdy se měří fluorescenční signál se zpožděním v homogenním prostředí. Donor (MAb-Eu³⁺ v micele) po ozáření dusíkovým laserem 337 nm emituje světlo 620 nm s dlouhou životností (ms), akceptor (MAb-sběrný protein) generuje signál 665 nm s krátkou životností (ns). Jestliže jsou obě složky v imunokomplexu, pak dochází v imunokomplexu k zesílení signálu a prodloužení jeho životnosti. Sendvičová reakce probíhá 14 min mezi CA 19-9 ze vzorku, monoklonální protilátkou vůči CA 19-9 značenou Eu³⁺ a monoklonální protilátkou vůči CA 19-9, která je připojena na sběrný protein. Měřený signál je po sendvičové imunoreakci (připojení obou značených monoklonálních protilátek k CA 19-9) přímo úměrný hladině CA 19-9. Na základě jednobodové kalibrace je rozsah měření 1,2 – 700 kU/l (po automatickém ředění až do 600000 kU/l). Analytická citlivost je 1,2 kU/l, funkční citlivost 7,2 kU/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 600000 kU/l. Preciznost v sérii 1,4 – 3,0 %, mezi sériemi 4,8 – 5,9 %. Hemoglobin neruší do 5 g/l, triacylglyceroly do 9 mmol/l, bilirubin nevadí. Linearita ředění je 95 – 115 %.

Chemiluminiscenční analýza v sendvičovém uspořádání používá monoklonální myší protilátku vůči 1116-NS-19-9 zakotvenou na paramagnetických částicích, ke které se přidává ředěný standard nebo vzorek. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá myší monoklonální protilátka vůči 1116-NS-19-9 značená akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je přímo úměrná hladině CA 19-9 a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Metoda dovoluje měřit vzorky na základě šestibodové kalibrace v rozmezí hodnot 2 – 1200 kU/l (Vzorky s hodnotami CA 19-9 > 1200 kU/l lze automaticky nebo manuálně ředit; při automatickém ředění systém vzorek naředí 10x, po ředění musí být hodnota > 30 kU/l). Preciznost v sérii je 2,3 – 8,0 %, celkově 3,4 – 8,5 %; zpětný výtěžek 89 – 108 %, linearita ředění 92 – 117 %. Analytická senzitivita (2 SD nulového kalibrátoru) ≤ 2 kU /l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 1750000 kU/l. Zavlečená chyba se do hodnoty 320000 kU/l neprojevila.

Podobný princip zábleskové luminiscence lze použít s esterem akridinujako značkou. Ke vzorku pacientského séra se přidá monoklonální myší protilátka vůči CA 19-9, která je vázaná kovalentně na paramagnetické částice ve fosfátovém pufru hovězího sérového albuminu. Inkubuje se 21 min při 37°C. Po odsátí roztoku a promytí zkumavek se přidá monoklonální myší protilátka vůči CA 19-9 značená esterem akridinu a inkubuje se 21,66 min při 37 °C.  Po odsátí roztoku a promytí zkumavek se přidá peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk fotonásobičem při 429 nm na základě šestibodové kalibrace. Vzorky s hladinou CA 19-9 > 700 kU/l se ředí 10x, 100x nebo 200x automaticky nebo manuálně. Analytická citlivost je 1,2 kU/l. Preciznost v sérii 3,5 – 10,4 %, mezi sériemi 2,4 – 5,3 %. Linearita ředění je 80 – 127 %, zpětný výtěžek 87,7 – 103,2 %. Analýzu neruší hemolýza, chylozita nebo ikterus, ačkoliv v preanalytické části se nedoporučuje zpracovávat takové vzorky. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 5800000 kU/l. Hemolýza, chylozita a ikterus dle výrobce neruší.

CLIA je další dvojstupňový zábleskový postup, kdy na magnetické částice potažené myší monoklonální protilátkou 1116NS se naváže během první inkubace (10 min) CA 19-9 a po promytí se na jeho další epitop připojí během další inkubace (10 min) druhá monoklonální protilátka 1116NS značená izoluminolem. Po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu přímo úměrná hladině CA 19-9. Rozsah měření je na základě dvoubodové kalibrace 0,3 – 1000 kU/l (při vyšších hodnotách lze sérum ředit diluentem dle potřeby). Analytická citlivost je 0,3 kU/l. Preciznost v sérii 1,9 – 10,0 %, mezi sériemi 4,9 – 7,5 %. Linearita ředění je 102 – 107 %, zpětný výtěžek 97 – 107 %. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 1550000 kU/l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší.

Jiné stanovení je založeno na sendvičové imunochemické reakci se sledováním luminiscence zesílené enzymem. CA 19-9 se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váže na myší monoklonální protilátku vůči CA 19-9 imobilizovanou na polystyrénové kuličce. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytím se na druhé vazebné místo CA 19-9 naváže druhá myší monoklonální protilátka vůči CA 19-9 konjugovaná s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření 425 – 500 nm je přímo úměrná koncentraci CA 19-9 ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Rozsah kalibrace je do 1000 kU/l, avšak do hodnoty 50000 kU/l nebyl pozorován efekt nadbytku protilátky. Analytická citlivost je 1 kU/l. Preciznost v sérii 4,2 – 7,5 %, mezi sériemi 5,5 – 6,9 %; zpětný výtěžek 96 – 108 %, linearita ředění 69 – 104 %. Hemolýza, chylozita a ikterus dle výrobce neruší.

Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530. Do zkumavky se pipetuje standard nebo vzorek obsahující CA 19-9, paramagnetické částice potažené kozí protilátkou proti biotinu, monoklonální myší protilátka vůči CA 19-9 s biotinovou kotvou a druhá monoklonální myší protilátka vůči CA 19-9 značená ALP. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je přímo úměrné množství CA 15-3. Rozsah měření při 470 nm na základě šestibodové kalibrace je 0,8 – 2000 kU/l. (po ředění 10x až do 20000 kU/l). Efekt nadbytku protilátky nebyl prokázán do 800000 kU/l. Preciznost v sérii je 1,7 – 6,4 %, mezi sériemi 2,4 – 5,7 %. Linearita ředění je 88,6 – 108,3 %.  

Chemiluminiscenční analýza v sendvičovém provedení, kdy CA 19-9 ze vzorku se váže na biotinylovanou myší monoklonální protilátku vůči 1116-NS-19-9. Imunokomplex se naváže na jamky potažené streptavidinem. Po inkubaci se promytím odstraní volný materiál a přidá se myší monoklonální protilátka vůči 1116-NS-19-9 značená křenovou peroxidázou. Po inkubaci se promytím odstraní volný materiál a přidá se luminogen (derivát luminolu + sůl peroxykyseliny) jehož oxidaci katalyzuje POD za vzniku světla. Činidlo pro přenos elektronů (substituovaný acetanilid) zvyšuje hladinu uvolněného světla a prodlužuje jeho emisi. Signál na základě dvoubodové kalibrace je přímo úměrný koncentraci CA 19-9 ve vzorku. Rozsah měření 1,4 – 1000 kU/l (vyšší koncentrace CA 19-9 jsou automaticky ředěné 20x). Analytická senzitivita 1,05 kU/l, funkční senzitivita 1,4 kU/l. Preciznost v sérii 0,9 – 1,4 %, mezi sériemi je 2,6 – 5,3 %. Hladiny biotinu zůstávají v séru zvýšené 24 h po podání. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 965000 kU/l. Při stanovení interferuje hemolýza (vyšší výsledky).

Homogenní chemiluminiscenční imunoanalýza v sendvičovém uspořádání je založena na technologii LOCI. Reagencie LOCI zahrnuji dvě syntetické reagencie na částicích a fragment monoklonální biotinylované protilátky vůči CA 19-9. První reagencie (Chemibeads) je potažena monoklonální protilátkou vůči CA 19-9 a obsahuje chemiluminiscenční barvivo. Druhá reagencie (Sensibeads) je pokryta streptavidinem a obsahuje fotosenzibilizační barvivo. Vzorek se inkubuje s biotinylovanou protilátkou CA 19-9 a reagencii Chemibeads a vytvoří se sendvičové komplexy: částice–monoklonální protilátka–CA 19-9–biotinylovaná protilátka. Poté jsou přidány reagencie Sensibeads, navážou se na biotin a vytvoří párové imunokomplexy s oběma částicemi. Ozářením komplexů světlem vlnové délky 680 nm se z reagencii Sensibeads uvolni singletový kyslík, který se rozptýlí do reagencii Chemibeads a spustí chemiluminiscenční reakci. Výsledný signál je měřen při vlnové délce 612 nm a je přímo úměrný koncentraci CA 19-9 ve vzorku. Analýza trvá 10 min při 37 °C. Rozsah metody na základě pětibodové kalibrace je 2 – 1000 kU/l (automatické ředění umožňuje zvětšit rozsah měření 20x nebo 100x; lze také ředit manuálně). Detekční limit je 1 kU/l. Preciznost v sérii 1,0 – 5,8 %, mezi sériemi 2,4 – 13,8 %. Zpětný výtěžek 91,8 – 115,5 %, linearita ředění 97,1 – 103,1 %. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 1000000 kU/l. Hemolýza, chylozita ani ikterus dle výrobce neruší.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou(ECLIA) v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (10 µl) je inkubován s monoklonální myší protilátkou vůči CA 19-9 značenou ruthéniovým komplexem a biotinylovanou monoklonální myší protilátkou vůči CA 19-9. Pak se přidají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem, na který se naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Luminiscence je přímo úměrná hladině CA 19-9 ve vzorku. Metoda je použitelná v rozsahu 0,6 – 1000 kU/l. Ředění při vyšších koncentracích 10x, je-li hodnota po ředění > 50 kU/l. Analytická citlivost (2 SD nulového kalibrátoru) je 0,6 kU/l, funkční citlivost (CV ≤ 20 %) 0,6 kU/l. Preciznost v sérii < 4,5 %, mezi sériemi < 4,9 %. Hemolýza, chylozita a ikterus neruší. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměli odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 500000 kU/l.

Toleranční limit EHK: 20 %.

Snížené hodnoty: efekt nadbytku antigenu, opakované rozmrazení séra, Lewis-a a Lewis-b negativní.

Zvýšené hodnoty: sliny, mléko, sputum, bronchiální sekret, seminální tekutina, cervikální mukus, žaludeční š
eáva, amniová tekutina, tekutina ovariálních cyst, moč, mekonium, stolice, cholestáza, menstruace, těhotenství (zvýšení do 70 – 120 kU/l), transplantace jater.

Heterofilní protilátky působí nespecificky.