Lyme borreliosis antibodies, Lyme disease antibodies, Lyme arthritis antibodies, Borrelia burgdorferi antibodies

Odběr se provádí minimálně 4 týdny po výskytu červené skvrny (erythema migrans). Analýza se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans EDTA nebo heparin). Doporučuje se opakovaný náběr za 4 – 8 týdnů. Stabilita v séru při laboratorní teplotě 2 d, při 2 – 8 °C 7 d, při -20 °C 6 – 12 měsíců. Hemolýza a chylozita při analýze ruší. Opakované rozmrazení se nedoporučuje. Průkaz je možné provádět i v moku.

ELISA IgG umožňuje in vitro semikvantitativní nebo kvantitativní vyšetření na protilátky třídy IgG vůči antigenům Borelií v séru nebo plazmě. Souprava testu obsahuje ulomitelné proužky, každý s osmi oddělenými reakčními jamkami potaženými směsí antigenů Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii, Borrelia garinii a rekombinantní VlsE (variable major protein-like sequence, expressed) Borrelia burgdorferi. V prvním kroku reakce jsou zředěné vzorky sér inkubovány v jamkách 30 min. V případě pozitivního vzorku se specifické IgG protilátky (také IgA a IgM) váží k antigenům. Po promytí pufrem (3x) se k detekci navázaných protilátek provádí následně inkubace 30 min s enzymovým konjugátem (králičí protilátka vůči lidskému IgG značená peroxidázou), který je schopen vyvolat barevnou reakci, následně po promytí pufrem (3x), s přidaným tetrametylbenzidinem a H₂O₂. Po 15 min ve tmě se reakce zastaví 0,5 M H₂SO₄ a intenzita vzniklého zabarvení je přímo úměrná koncentraci IgG protilátek proti antigenům Borelií. Měření se provádí při 450/620-650 nm do 30 min. Celý postup se provádí za laboratorní teploty. Semikvantitativní výsledky jsou hodnoceny v poměru k absorbanci kalibrátoru 2 tak, že výsledky < 0,8 jsou negativní; 0,8 až 1,1 jsou hraniční a > 1,1 jsou pozitivní. Při kvantitativním hodnocení se koncentrace protilátek vůči Boreliím ve vzorku < 16 arb.j./ml hodnotí jako negativní (bez imunitní odezvy), koncentrace > 22 arb.j./ml jako pozitivní (s imunitní odezvou) a koncentrace mezi 16 a 22 arb.j./ml jako hraniční (nejasná). Měření se provádí v rozsahu 2 až 200 arb.j./ml. Jestliže absorbance překračuje tuto hodnotu, jež odpovídá kalibrátoru 1, je třeba vzorek ředit 4x a výsledek násobit čtyřmi. Detekční limit: přibližně 1 arb.j./ml. Přesnost v sérii 3,5 – 3,6 %, mezi sériemi 3,6 – 3,8 %. Senzitivita: 90,3 %, specifita: 100 %. Test je pouze orientační a pozitivní výsledek je nutné potvrdit ještě metodou western blot. Hemolytické, lipemické a ikterické vzorky nevykazují žádné interference do koncentrací 10 g Hb/l, 22,6 mmol/l TAG a 684 µmol/l bilirubinu.

ELISA IgM umožňuje in vitro semikvantitativní nebo kvantitativní vyšetření na protilátky třídy IgM vůči antigenům Borelií v séru nebo plazmě. Souprava testu obsahuje ulomitelné proužky, každý s osmi oddělenými reakčními jamkami potaženými směsí antigenů Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii, Borrelia garinii. V prvním kroku reakce jsou zředěné vzorky sér inkubovány v jamkách 30 min. V případě pozitivního vzorku se specifické IgM protilátky (také IgA a IgG) váží k antigenům. Po promytí pufrem (3x) se k detekci navázaných protilátek provádí následně inkubace 30 min s enzymovým konjugátem (králičí protilátka vůči lidskému IgM značená peroxidázou), který je schopen vyvolat barevnou reakci, následně po promytí pufrem (3x), s přidaným tetrametylbenzidinem a H₂O₂. Po 15 min ve tmě se reakce zastaví 0,5 M H₂SO₄ a intenzita vzniklého zabarvení je přímo úměrná koncentraci IgM protilátek proti antigenům Borelií. Semikvantitativní výsledky jsou hodnoceny v poměru k absorbanci kalibrátoru 2 tak, že výsledky < 0,8 jsou negativní; 0,8 až 1,1 jsou hraniční a > 1,1 jsou pozitivní.  Při kvantitativním hodnocení se koncentrace protilátek vůči Boreliím ve vzorku < 16 arb.j./ml hodnotí jako negativní (bez imunitní odezvy), koncentrace > 22 arb.j./ml jako pozitivní (s imunitní odezvou) a koncentrace mezi 16 a 22 arb.j./ml jako hraniční (nejasná). Měření se provádí v rozsahu 2 až 200 arb.j./ml. Jestliže absorbance překračuje tuto hodnotu, jež odpovídá kalibrátoru 1, je třeba vzorek ředit 4x a výsledek násobit čtyřmi. Detekční limit: přibližně 1 arb.j./ml. Přesnost v sérii 2,9 – 4,3 %, mezi sériemi 4,7 – 6,9 %. Senzitivita: 100 %, specifita: 96,4 %. Test je pouze orientační a pozitivní výsledek je nutné potvrdit ještě metodou western blot. Hemolytické, lipemické a ikterické vzorky nevykazují žádné interference do koncentrací 10 g Hb/l, 22,6 mmol/l TAG a 684 µmol/l bilirubinu.

Nepřímá imunofluorescence Séra z infikovaných křečků bez zpracování nebo po zpracování s antimikrobiálním činidlem byla inaktivována při 56 °C 30 min a naředěna přefiltrovaným sterilizačním médiem. Do jamek mikrotitračních destiček byla pipetována analyzovaná séra a přidáno sérum obsahující Borrelia burgdorferi. Po inkubaci 1 h při 32 °C byl přidán konjugát fluorescein izotiokyanátu s kozí protilátkou vůči křeččím imunoglobulinům (těžkým a lehkým řetězcům). Následovala další inkubace 1 h při 32 °C. Pak byly vzorky naředěny 5x fosfátovým pufrem a analyzovány v průtokovém cytometru. Titr nepřímé fluorescence (excitace 488 nm, emise 530 nm) byla hodnota ředění, při které došlo ke změně fluorescence < 5 %.

Western blot se používá jako konfirmační test. Spirochéty vyrostlé v médiu jsou 2x promyty fosfátovým pufrem a je stanovena jejich koncentrace. Antigeny byly povařeny 5 min v pufru a naneseny na 12 % polyakrylamidový redukční gel. Proužky gelu byly pak paralelně použity v elektroforetické jednotce (30 mA, 3 h). Po elektroforéze byly antigeny přeneseny na nitrocelulózu během 90 min při proudu 1 A; nitrocelulóza byla pak rozřezána na proužky a blokována po dobu 30 min 5 % mlékem ve fyziologickém roztoku s TRIS pufrem a Tween detergentem. Pak byla přidána analyzovaná ředěná séra a inkubována 60 min za laboratorní teploty a třepání s 5 % mlékem ve fyziologickém roztoku s TRIS pufrem a Tween detergentem. Po promytí proužků následovala inkubace 60 min s kozí protilátkou vůči křeččímu IgG (těžké a lehké řetězce) ve fyziologickém roztoku s TRIS pufrem a Tween detergentem. Proužky byly opět promyty a barveny 5-brom-4-chlor-3-indolylfosfát toluidinnitrotetrazoliovou modří. Intenzita zbarvení jednotlivých pásů byla hodnocena vizuálně od 0 do 4. Některé proužky byly inkubovány s monoklonálními protilátkami vůči boreliovým proteinům pro srovnání. IgG pozitivita je průkaz jakýkoliv pěti z 10 antigenů: 18, 23, 28, 30, 39, 41, 45, 58, 66, nebo 93 kDa. Hodnoty hraniční jsou při výskytu 3 – 4 antigenů, negativní při výskytu 1 – 2 antigenů. Pro průkaz IgM protilátek je třeba použít kozí protilátku vůči křeččímu IgM ve fyziologickém roztoku s TRIS pufrem a Tween detergentem. IgM pozitivita je průkaz alespoň dvou z těchto antigenů: 23 (OspC), 39 (BmpA), 41 kDa. Negativní je nález při detekci jednoho antigenu z uvedených.

Hodnoty snižuje: pomalá tvorba protilátek v časném stádiu onemocnění, intenzivní antibiotická nebo imunosupresivní léčba, uzavření protilátek v imunitních komplexech, opožděná sérokonverze, někdy v těhotenství.

Hodnoty zvyšuje: Protilátky vůči p31 (OspA) ve třídě IgM mohou být u zkřížené reakce proti lidskému leukocytárnímu antigenu. Zkřížená reakce může být také u syfilis, leptospirózy, systémového lupus erythematodes, autoimunit, viru Epstein-Barrové, cytomegaloviru a revmatoidní artritidy.