TnI, cTnI (oficiální zkratka není)

K analýze se používá sérum nebo heparinizovaná plazma. Výsledky v plazmě mohou být až o 30 % nižší než
v séru.
Stabilita vzorku: 20 - 25 °C: 6 – 24 h, 2 - 8 °C: 4 – 14 dní, -20 °C: 2 – 3 měsíce. Dlouhodobě skladovat při
-70 °C. Opakované zamrazení se nedoporučuje. Vzorky obsahující sraženinu se musí před analýzou centrifugovat.
Hemolýza ruší při některých imunoanalytických postupech. Přítomnost myších protilátek ovlivňuje analýzy. Interference může být negativní nebo pozitivní podle typu HAMA. Biologický poločas je nejasný: 2 – 4 h, jinde
2 dny nebo dokonce 4 – 14 dnů.

Současné metody ke stanovení troponinu I jsou imunoanalýzy vyžadující dvě vazebná místa. Všechny postupy používají imobilizovanou protilátku na kterou se váže troponin I ze séra nebo plazmy. Ten pak reaguje s druhou protilátkou, konjugovanou na marker. Analýzy se liší podle použité protilátky a typu značky. Troponin I může být buď ve volné formě, nebo vázaný na sérové proteiny.

Heterogenní sendvičová magnetická separační imunoanalýza (MSA) zahajuje navázáním troponinu I ze séra na monoklonální myší protilátku zakotvenou na magnetické částici. Imunokomplex pak reaguje s polyklonální kozí protilátkou značenou enzymem (ALP). ALP reaguje s p-nitrofenylfosfátem a vznik p-nitrofenolu se sleduje při 405 nebo 450 nm fotometricky. Absorbance je přímo úměrná koncentraci TnI ve vzorku. Mez detekce je 0,1 µg/l, rozsah měření do 200 µg/l. Uváděná diagnostická cutoff hodnota 0,1 µg/l. Preciznost metody v sérii je CV 0,8 – 2,3 %, mezi sériemi 2,0 – 3,3 %.
Další enzymová imunoanalýza na sendvičovém principu používá jednokrokovou reakci, kdy je vzorek inkubován s oxidem chromičitým potaženým monoklonální protilátkou vůči TnI. Troponin I ze séra se jedním epitopem naváže a druhým epitopem se váže na monoklonální protilátku značenou ALP. Nenavázaný konjugát je odstraněn promytím s magnetickou separací. Sendvič oxid chromičitý-Ab₁-TnI-Ab₂- ALP do další zkumavky, kde ALP defosforyluje flavinadenindinukleotid fosfát na FAD, který se váže na apo-D-aminokyselinovou
oxidázu a přeměňuje ji na aktivní holo-D-aminokyselinovou oxidázu. Každá molekula tohoto enzymu pak vytváří mnoho molekul peroxidu vodíku, který v přítomnosti křenové peroxidázy převádí kyselinu 3, 5-dichlor-
2-hydroxybenzensulfonovou a 4-aminoantipyrin na barevný produkt, absorbující při 510 nm. Barevná změna je přímo úměrná koncentraci TnI ve vzorku. Rozsah měření 0,04 – 40 µg/l (vyšší koncentrace nutno ředit). Uváděná diagnostická cutoff hodnota 1,5 µg/l. Reprodukovatelnost v sérii CV 1,9 – 7,3 %, celková reprodukovatelnost 3,6 – 15,1 % (nejvyšší hodnoty při koncentraci 0,08 µg/l). Analytická citlivost je 0,04 µg/l, funkční citlivost (CV 10 %) je 0,14 µg/l. Výtěžnost metody je 98,6 – 106,4 %. Efekt nadbytku antigenu se neprojevil do 1800 µg/l.
Fluorescenční imunoanalýza používá dvě monoklonální protilátky. Vzorek je pipetován do středu čtvercového políčka skleněných vláken, na kterých je zakotvená myší monoklonální protilátka. Po krátké inkubaci se přidá myší monoklonální protilátka značená ALP (z telecích jater), která se během další inkubace naváže na druhé vazebné místo TnI. Substrát (4-metylumbeliferylfosfát) pak vymyje přebytek volné značené protilátky při radiální separaci. Sleduje se kinetika nárůstu povrchové fluorescence 4-metylumbeliferonu, která je daná enzymovou aktivitou vázané frakce a tedy přímo úměrná koncentraci TnI ve vzorku. Fluorescence se porovnává s kalibrační křivkou. Doba analýzy je 10 min. Mez detekce je 0,6 µg/l, rozsah měření 0,35 – 50 µg/l. Uváděná diagnostická cutoff hodnota 1,5 µg/l. Reprodukovatelnost v sérii má CV 4,7 – 10,1 %, mezi sériemi 5,8 – 11,1 %. Tento postup byl první široce rozšířenou metodou. V současnosti se převážně používají citlivější a více automatizované postupy.
Technologie MEIA (enzymová imunoanalýza na mikročásticích) je velmi podobná předchozímu postupu. Kotvící protilátka (na latexových mikročásticích o průměru 0,47 µm) je kozí polyklonální a protilátka (značená ALP)
v indikačním kroku je monoklonální myší. K rozdělení volné a vázané frakce dochází na fritě ze skleněných vláken pomocí substrátu (4-metylumbeliferylfosfát). Ten je hydrolyzován ALP a fluorescence 4-metylumbeliferonu se sleduje při 450 nm. Fluorescence je přímo úměrná koncentraci TnI (aktivitě ALP). Mez detekce je 0,4 µg/l, rozsah měření 0,30 – 50 µg/l (po ředění 10x až 500 µg/l). Uváděná diagnostická cutoff hodnota 2,0 µg/l. Reprodukovatelnost v sérii má CV 3,2 – 6,4 %, mezi sériemi 3,9 – 5,2 %.
Chemiluminiscenční sendvičová imunoanalýza používá monoklonální myší kotvící protilátku (na magnetických kuličkách) a druhou polyklonální kozí protilátku značenou esterem akridinu. Luminiscence je nastartována hydrolýzou esteru alkalickým peroxidem vodíku a měří se při 400 nm fotonásobičem. Signál je přímo úměrný koncentraci TnI. Mez detekce je 0,15 µg/l, rozsah měření 0,15 – 50 µg/l. Uváděná diagnostická cutoff hodnota 1,5 µg/l. Preciznost v sérii CV 1,4 – 3,9 %, mezi sériemi 1,4 – 4,5 %.
Podobná imunoreakce probíhá na paramagnetických mikročásticích (CMIA) potažených protilátkou vůči TnI. Po jeho navázání a promytí se připojí druhá protilátka značená derivátem akridinu. Po přidání hydroxidu sodného
a peroxidu vodíku se měří na základě kalibrační křivky chemiluminiscence, která je přímo úměrná koncentraci TnI ve vzorku. Analytická citlivost 0,01 µg/l. Uváděná diagnostická cutoff hodnota je 0,3 µg/l. Rozsah měření bez ředění do 50 µg/l. Preciznost v sérii měla CV 2,3 – 5,3 %, celkem 3,0 – 5,8 %. Odezva na linearitu byla 83 –
103 %. Interference HAMA jsou -4,5 % a revmatoidního faktoru -3,5 %.
Jiný typ chemiluminiscenční analýzy používá monoklonální myší protilátku zakotvenou na paramagnetických částicích, druhou myší protilátku značenou ALP a jako volný substrát Lumi-Phos 530. Luminiscence po magnetické separaci a okyselení je přímo úměrná koncentraci TnI. Doba odezvy je 15 min. Mez detekce je
0,03 µg/l (0,01 µg/l), rozsah metody 0,03 – 50 µg/l. Uváděná diagnostická cutoff hodnota je 0,15 µg/l. Preciznost
v sérii se pohybovala podle měřené koncentrace od CV 22,9 % (0,0177 µg/l), přes 13,8 % (0,0290 µg/l) a 6,9 % (0,0826 µg/l) po 5,5 % (0,3090 µg/l).
Sendvičová chemiluminiscence používá jamky potažené streptavidinem na kterých se přes biotinylovou kotvu zachytí první myší monoklonální protilátka. Na ní se zachytí TnI ze vzorku a na jeho druhé vazebné místo se zachytí druhá protilátka značená křenovou peroxidázou (POD). Nenavázaný materiál se odstraní promytím. Navázaný konjugát se měří pomocí luminiscenční reakce. Do jamek se přidá reagencie obsahující luminogenní substráty (derivát luminolu a sůl kyseliny peroctové) a činidlo přenášející elektrony. POD
v navázaném konjugátu katalyzuje oxidaci derivátu luminolu za vzniku světla. Činidlo pro přenos elektronů (substituovaný acetanilid) zvyšuje hladinu uvolněného světla a prodlužuje jeho emisi. Množství navázaného konjugátu je přímo úměrné koncentraci přítomného TnI. Výsledek je k dispozici za 18 min. Mez detekce je
0,02 µg/l. Rozsah měření 0,0122 – 80 µg/l. Uváděná diagnostická cutoff hodnota je 0,12 µg/l. Preciznost v sérii CV 0,9 – 2,8 %, mezi sériemi 2,8 – 9,8 %.
 LOCI technologie (Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay) je homogenní sendvičová chemiluminiscenční imunoanalýza. První činidlo obsahuje latexovou kuličku potaženou monoklonální protilátkou vůči TnI + chemiluminiscenčním barvivem a také volný fragment F(ab´)₂ monoklonální protilátky vůči TnI s biotinovou kotvou. Druhé činidlo obsahuje jinou latexovou kuličku potaženou streptavidinem
a fotosenzitivní barvivo. Vzorek se inkubuje s prvním činidlem a na kuličku s monoklonální protilátkou vůči TnI se naváže antigen TnI a na něj druhá protilátka s volnou biotinylovou kotvou (vytvoří se sendvič). Pak se přidá druhé činidlo a vytvoří se můstek streptavidin-biotin. Při iluminaci zářením 680 nm se z fotosenzitivního barviva druhé kuličky uvolní kyslík ve formě radikálu a difunduje do chemiluminiscenčního barviva první kuličky, kde vyvolá emisi světla 612 nm, která je přímo úměrná koncentraci TnI ve vzorku. Analytická citlivost 0,015 µg/l, funkční citlivost (CV 10 %) je 0,04 µg/l. Rozsah metody je 0,015 – 40 µg/l. Uváděná diagnostická cutoff hodnota je 1,5 µg/l. Preciznost v sérii CV 2,2 – 4,3 %, mezi sériemi 3,6 – 9,4 %; výtěžnost 99,1 – 99,2 %. Efekt nadbytku antigenu se neprojevil do 1000 µg/l.
LIA stanovení s využitím volného substrátu je založeno na sendvičové imunochemické reakci. Troponin I se
v prostředí pufrovaného roztoku jedním epitopem váže na myší protilátku imobilizovanou na polystyrénové kuličce a druhým epitopem reaguje s kozí protilátkou konjugovanou s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá
20 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se ihned rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření je přímo úměrná koncentraci TnI ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané
z čárového kódu činidla. Linearita metody je do 180 µg/l. Detekční limit: 0,15 µg/l, rozsah měření do 180 µg/l. Preciznost v sérii CV 2,7 – 5,8 %, mezi sériemi 3,7 – 8,4 %.

Řada firem také nabízí kvalitativní průkaz troponinu I a využívá jako značku buď koloidní zlato a technologie bývá označována jako GLORIA (gold-labelled optically read immunoassay), nebo v poslední době častěji i jiná barviva. Cutoff 0,14 µg/l dosahuje se spolehlivostí 98,9 %. Jiný proužek je vybaven filtrem a lze nanášet celou krev. Plazma v reakční zóně vykazuje fluorescenci při koncentraci TnI 0,4 µg/l s CV 12 %.

Referenční materiál NIST z roku 2004, označený SRM 2921 (Human Cardiac Troponin Complex), nevedl
k dosažení žádoucí srovnatelnosti mezi jednotlivými analytickými postupy. Uvažuje se o referenční metodě ELISA, podepřené stanovením HPLC. V současnosti není mezinárodní shoda pro výsledky stanovení troponinu I, protože naměřené hodnoty mezi jednotlivými postupy se mohou lišit desetkrát a více. Tyto rozdíly jsou způsobeny rozdíly ve standardech a protilátkách. Současné doporučení připouští preciznost CV do 10 % na rozhodovací mezi pro akutní infarkt myokardu. College of American Pathologists (2001) uvádí hodnoty
v intervalu 8 – 21 %.

Toleranční limit EHK: 30 %.

Koncentrace troponinu I je snížena: citronan (-30 % proti séru), EDTA (-30 % proti séru), heparin (-30 % proti séru), hemoglobin (při koncentraci 4 g/l), aj.
Koncentrace troponinu I je zvýšena: cvičení, kardiální chirurgie, aj.