anti-mikrosomy, protilátky vůči tyreoidální peroxidáze, Anti-TPO, Anti TPO;

Anti-thyroid peroxidase antibodies, anti-TPO antibodies, Anti-Thyroid Peroxidase Antibodies (TPO), Thyroid peroxidase antibody, Thyroid antimicrosomal antibody, TPO-Ab, Anti-Microsomal Antibodies (AMA), Antimicrosomal antibody, Microsomal antibody.

Poznámka: přestože v literatuře jsou výše uvedené názvy používány jako synonyma, není to zcela přesné; tyroidní peroxidáza je hlavním, ale nikoliv jediným antigenem mikrosomů, takže název anti-mikrosomy je obecnější (širší) než anti-TPO.

Stanovení se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans heparinát lithný nebo sodný, EDTA, citronan, fluorid, š
eavelan). Stabilita protilátek: 1 – 2 d při 20 – 24 °C, 3 – 7 d při 4 – 8 °C, 1 – 3 měsíce při -20 °C.

Pasivní hemaglutinace využívá taninované erytrocyty (nebo gelové partikule) potažené mikrosomy ze štítné žlázy. Po smíchání se vzorkem se stanovované protilátky naváží na zakotvený antigen a dochází k aglutinaci. Obvykle se provádí ředění a sleduje se titr, při kterém ještě dochází k hemaglutinaci. Stanovení je semikvantitativní a provedení je jednoduché. Komerční soupravy jsou dostupné.

Metody, které používají citlivější markery, než erytrocyty, jsou také specifičtější.

RIA protilátek proti lidské TPO je kompetitivní stanovení. Neznámé vzorky, kontrolní vzorky a kalibrátory se spolu s ¹²⁵I-TPO inkubují (60 min, laboratorní teplota, třepání) ve zkumavkách potažených dvěma monoklonálními protilátkami vůči TPO. Po inkubaci se obsah zkumavek odsaje, promyje a navázaná aktivita se změří gama-počítačem (1 min). Sestrojí se šestibodová kalibrační křivka a z ní se odečtou koncentrace protilátek vůči TPO v neznámých vzorcích (nepřímá úměra signálu). Rozsah metody je 2 – 2500 kU/l. Funkční senzitivita (CV ≤ 20 %) je 6,1 kU /l, analytická senzitivita (2 SD nulového kalibrátoru) 2 kU /l. Preciznost v sérii ≤ 12,4 %, mezi sériemi je ≤ 12,5 %. Ruší hemolýza a chylozita. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým stanovením.

Jiná varianta používá zkumavky potažené streptavidinem. Kompetice pak probíhá mezi lidskou anti-TPO s biotinovou kotvou a anti-TPO ze vzorku o vazbu s ¹²⁵I-TPO. Po inkubaci (2 h, laboratorní teplota, třepání) se obsah zkumavek odsaje, promyje a navázaná aktivita se změří gama-počítačem (1 min). Sestrojí se pětibodová kalibrační křivka a z ní se odečtou koncentrace protilátek vůči TPO v neznámých vzorcích (nepřímá úměra signálu). Rozsah metody je 1,9 – 1900 kU/l. Funkční senzitivita (CV ≤ 20 %) je 6 kU/l, analytická senzitivita (2 SD nulového kalibrátoru) 1,9 /l. Preciznost v sérii 4,4 – 9,3, mezi sériemi je 5,4 – 12,4 %.

IRMA postup začíná pipetováním ředěného séra do zkumavek potažených TPO. Po inkubace (2 h, 37 °C) se supernatant odsaje a zkumavky se promyjí. Dále se přidá ¹²⁵I-Protein A. Opět se inkubuje (2 h, 37 °C), supernatant odsaje a zkumavky se promyjí. Navázaná aktivita se změří gama-počítačem (2 min). Preciznost v sérii je 2,8 – 11,6 %, mezi sériemi 12 – 20 %. 

ELISA používá mikrotitrační destičky se zakotveným streptavidinem. První se pipetuje kalibrátor nebo ředěný vzorek a potom biotinylovaná anti-TPO. Po inkubaci (60 min) se odsaje roztok, jamky se 3x promyjí. Přidá se protilátka vůči lidskému IgG značená křenovou peroxidázou. Dále následuje inkubace 30 min., roztok se odsaje, jamky se 3x promyjí a pak se přidá tetrametylbenzidin s H₂O₂ a za 15 min stop činidlo (1 M HCl). Měření se provádí bichromaticky při 450 nm (proti 620 – 630 nm) do 30 min na základě šestibodové kalibrace v rozmezí 1,5 – 500 kU/l. Analýza se provádí za laboratorní teploty. Silná hemolýza a lipémie ruší. Analytická citlivost (2 SD nulového kalibrátoru) je 0,92 kU/l. Preciznost v sérii 3,8 – 5,7 %, mezi sériemi 4,5 – 6,8 %. Tyreoglobulin při stanovení neinterferuje.

Jiná ELISA souprava má v jamkách přímo zakotvenou rekombinantní tyreoidální peroxidázu. Tetrametylbenzidin nemusí obsahovat peroxid vodíku a jako stop činidlo se může použít ředěná kyselina sírová (0,2 M). Barevná reakce se provádí ve tmě a první sekvence sendvičové rekce je kratší (pouze 30 min). Preciznost je srovnatelná s předchozí metodou. Analytická citlivost je < 0,5 kU/l. Rozsah měření do 320 kU/l.

K dispozici je také ELISA souprava umožňující stanovit současně anti-TG a anti-TPO.

Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) probíhá tak, že se do reakční nádobky dávkuje vzorek ředěný fosfátový pufrem a poté latexové mikročástice potažené tyreoidální peroxidázou. Po inkubaci se reakční směs přenese na fritu a nenavázaný materiál se oddělí promytím. Přidá se kozí protilátka vůči lidskému IgG značená ALP v pufru TRIS. Po inkubaci a promytí se dávkuje substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí na fluoreskující umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky. Šestibodová kalibrace je v rozsahu 1 – 1000 kU/l. (Vzorky s hodnotami anti-TPO > 1000 kU/l lze automaticky nebo manuálně ředit; při automatickém ředění systém vzorek naředí 10x – hodnota po ředění musí být > 8 kU/l). Preciznost v sérii je 5,8 – 11,1 %, celková preciznost metody je 8,1 – 12,4 % linearita ředění 94,0 – 114,2 %. Analytická senzitivita je 1 kU/l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší.

Zesílená fluorescence rozložená v čase je označována jako TRACE (time resolved amplified cryptate emission), kdy se měří fluorescenční signál se zpožděním v homogenním prostředí. Donor (MAb-Eu³⁺ v micele) po ozáření dusíkovým laserem 337 nm emituje světlo 620 nm s dlouhou životností (ms), akceptor (MAb-sběrný protein) generuje signál 665 nm s krátkou životností (ns). Jestliže jsou obě složky v imunokomplexu, pak dochází v imunokomplexu k zesílení signálu a prodloužení jeho životnosti. Kompetitivní reakce probíhá 19 min mezi anti-TPO ze vzorku a monoklonální anti-TPO-Eu³⁺ o vazbu na tyreoidální peroxidázu, která je připojena přes monoklonální anti-TPO na sběrný protein. Měřený signál je po kompetitivní imunoreakci nepřímo úměrný hladině anti-TPO. Na základě jednobodové kalibrace je rozsah měření 10 – 5000 kU/l (po automatickém ředění až do 500000 kU/l). Analytická citlivost je 10 kU/l, funkční citlivost (CV ≤ 20 %) 50 kU/l. Preciznost v sérii 2,1 – 7,6 %, mezi sériemi 5,8 – 16 %. Linearita ředění je 80 – 120 %. Anti-TG neruší do 1735 kU/l, hemoglobin < 5 g/l, triacylglyceroly < 2,6 mmol/l, bilirubin < 684 µmol/l, RF < 1200 kU/l.

DELFIA (Dissociation-enhanced Lanthanide Fluoroimmunoassay) používá mikrotitrační destičky potažené streptavidinem. V první inkubaci (2h, třepání) se naváže biotinylovaná tyreoidální peroxidáza, kalibrátor nebo vzorek (se stanovovanou anti-TPO) a současně se naváže na druhý paratop protilátky TPO-Eu³⁺. Po promytí 6x se přidá zesilující roztok, inkubuje se 15 min a pak se měří fluorescence (excitace 320 nm, emise 615 nm). Rozsah metody je 1,19 – 4140 kU/l. Celý postup se provádí za laboratorní teploty. Preciznost v sérii 5,4 – 7,0 %, mezi sériemi 9,8 – 13,0 %.

Chemiluminiscenční analýza v sendvičovém uspořádání používá tyreoidální peroxidázu zakotvenou na paramagnetických částicích, ke které se přidává ředěný standard nebo vzorek. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá myší monoklonální protilátka vůči lidskému IgG značená akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je přímo úměrná hladině anti-TPO a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Metoda dovoluje měřit vzorky na základě šestibodové kalibrace v rozmezí hodnot 3 – 1000 kU/l (Vzorky s hodnotami anti-TPO > 1000 kU/l lze automaticky nebo manuálně ředit; při automatickém ředění systém vzorek naředí 2x, při hodnotách > 2000 kU/l se ředí manuálně). Preciznost v sérii 1,8 – 9,5 %, celkově 2,5 – 9,8 %; linearita 95,7 – 103,1 %. Funkční senzitivita (CV ≤ 20 %) je 0,5 kU /l, analytická senzitivita (2 SD nulového kalibrátoru) 0,16 kU /l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým stanovením.

Podobný princip zábleskové luminiscence, avšak v sekvenčním a kompetitivním uspořádání lze použít s esterem akridinu jako značkou. Ke vzorku pacientského séra se přidá lidská tyreoidální peroxidáza spojená s monoklonální myší protilátkou vůči TPO značenou esterem akridinu ve fosfátovém pufru hovězího sérového albuminu. Po inkubaci 2,5 min při 37 °C se přidá monoklonální myší protilátka vůči TPO, která je vázaná kovalentně na paramagnetické částice ve fosfátovém pufru hovězího sérového albuminu. Reakce probíhá 5 min při 37 °C.  Po odsátí roztoku a promytí zkumavek se přidá peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk fotonásobičem při 429 nm na základě šestibodové kalibrace. Vzorky s hladinou anti-TPO > 1300 kU/l se ředí 5x, což dovoluje měření do 6500 kU/l. Analytická citlivost je 15 kU/l, funkční citlivost (CV ≤ 20 %) 25 kU/l. Preciznost v sérii 1,6 – 4,1 %, mezi sériemi 3,4 – 8,0 %. Linearita ředění je 83,7 – 136,2 %, zpětný výtěžek 93,3 – 115,1 %. Analýzu neruší hemolýza, chylozita nebo ikterus. Heterofilní protilátky v lidském séru/plazmě mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým stanovením.

CLIA je další dvojstupňový zábleskový postup, kdy se na magnetické částice potažené rekombinantní TPO naváže anti-TPO během první inkubace (10 min) a po promytí se na jeho další epitop připojí během další inkubace (10 min) polyklonální kozí protilátka vůči lidskému IgG značená izoluminolem. Po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu přímo úměrná hladině anti-TPO. Rozsah měření je na základě dvoubodové kalibrace 1 – 2000 kU/l (vzorky s koncentrací anti-TPO přesahující rozsah měření lze ředit diluentem dle potřeby). Analytická citlivost je 0,6 kU/l, funkční citlivost 1,0 kU/l. Preciznost v sérii 3,6 – 7,4 %, mezi sériemi 4,7 – 12,7 %. Linearita ředění je 89 – 101 %, zpětný výtěžek 92 – 100 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší.

Jiné stanovení je založeno na sekvenční imunochemické reakci. Protilátky proti tyreoidální peroxidáze se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin bez protilátek anti-TG/anti-TPO váží na vysoce purifikovanou tyreoidální peroxidázu imobilizovanou na polystyrénové kuličce. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se na druhé vazebné místo anti-TPO naváže monoklonální myší protilátka vůči lidskému IgG konjugovaná s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření 425 – 500 nm je přímo úměrná koncentraci anti-TG ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Rozsah kalibrace je do 1000 kU/l, avšak do hodnoty 16624 kU/l nebyl pozorován efekt nadbytku protilátky. Sérum je před analýzou automaticky ředěno analyzátorem 100x a diluent s bílkovinnou matricí bez protilátek anti-TG a anti-TPO se stabilizátorem je součástí soupravy. Funkční citlivost (CV ≤ 20 %) je 5 kU/l. Preciznost v sérii (177 kU/l) < 7,5 %, v čase (53 kU/l) < 7,3 %, zpětný výtěžek 85 – 103 %. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým stanovením. Neinterferují bilirubin (< 342 µmol/l), hemoglobin (< 3,81 g/l), lipidy (< 30 g/l).

Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530. Do zkumavky se pipetuje standard nebo vzorek obsahující stanovované protilátky a paramagnetické částice potažené TPO. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky a přidá protein A značený ALP. Následuje druhá inkubace, separace v magnetickém poli a promytí. Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je přímo úměrné množství anti-TPO. Rozsah měření při 470 nm na základě šestibodové kalibrace je 0,3 – 1000 kU/l. Efekt nadbytku protilátky nebyl prokázán do 10000 kU/l. Preciznost v sérii je 6,3 – 7,6 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší. Heterofilní protilátky v lidském séru/plazmě mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým stanovením.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v kompetitivním uspořádání trvá 18 min. Vzorek (20 µl) je temperován s polyklonálními ovčími protilátkami vůči TPO značenými ruthéniovým komplexem. Po přidání biotinylované rekombinantní TPO a paramagnetických částic potažených streptavidinem dochází ke kompetici o vazebná místa na anti-TPO a imunokomplex se naváže na paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem pomocí biotin-streptavidinové kotvy. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Luminiscence je nepřímo úměrná hladině anti-TPO ve vzorku. Hemolýza, chylozita, ikterus a RF (< 1500 kIU/l) neruší. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměli odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Metoda je použitelná v rozsahu 5 – 600 kU/l. Ředění při vyšších koncentracích 5x, je-li hodnota po ředění > 200 kU/l (autoprotilátky odpovídají nelineárně). Analytická citlivost (2 SD nulového kalibrátoru) je < 5 kU/l. Reprodukovatelnost v sérii CV 2,5 – 7,0 %, mezi sériemi 7,6 – 24,4 %. Ruší velmi vysoké hodnoty protilátek vůči streptavidinu a rutheniu. Anti-TG < 394 kU/l stanovení neovlivňovaly.

Mezinárodní standard je označen MRC 66/387.

Hodnoty snížené: při velmi vysokém věku (> 90 let).

Hodnoty zvýšené: u 5 – 10 % zdravých (po šedesátce více v důsledku asymptomatické lymfocytární tyreoitidy, někdy interferují anti-TG, z léků interferon α.