Parainfluenza virus types 1 – 4, Paraflu antibodies, Parainfluenza antibodies, PIV Abs

Odběr krve se provádí ráno nalačno. Následný odběr za 14 – 24 dní. Sérum, plazma (antikoagulans citrát) je stabilní za laboratorní teploty 2 d, při 4 – 8 °C 5 – 14 d, při -20 °C 1 rok. Je možné provádět i vyšetření v likvoru.

Pokud jsou testy specifické pro jednotlivé protilátky (IgG, IgM, IgA), jsou deklarovány na protilátky vůči virům typu 1 – 3.

Komplement fixační reakce V reakci je pět složek: antigen (Prainfluenza virus), vyšetřované sérum pacienta, komplement, beraní krvinky, králičí sérum s protilátkami proti beraním krvinkám (tzv. amboceptor). Princip reakce lze popsat ve 4 krocích: smísí se zkoumané sérum (ředěné 1:8 až 1:64), v němž byl inaktivován vlastní komplement a příslušný antigen (pozitivita: vzniknou komplexy antigen-protilátka, negativita: komplexy antigen-protilátka nevzniknou); přidá se morčecí komplement alexin – inkubace alespoň 12 h při 4 °C (pozitivita: komplement se vyváže na komplexy antigen-protilátka, negativita: komplement se nevyváže a je nadále aktivní); mimo reakci se připraví tzv. hemolytický systém, tj. ovčí krvinky s navázanými protilátkami proti těmto (zdrojem protilátek je obvykle králičí antisérum proti ovčím krvinkám); do reakce se přidá hemolytický systém – inkubace 30 – 60 min při 37 °C (pozitivita: komplement je vyvázán, tedy neaktivní a nedojde k hemolýze, negativita: komplement se vyváže na hemolytický systém tj. vlastně komplexy antigen-protilátka a dojde k hemolýze. Komplement fixační reakce trvá celkem 16 h a hodnotí se v několika ředěních séra. Jako výsledek se udává nejvyšší ředění séra (titr), při kterém ještě nedošlo k hemolýze. Reakce je citlivá, ale nelze rozlišit jednotlivé třídy protilátek. Reakce je pozitivní jak na IgG tak na IgM protilátky při titru 1:8 nebo vyšším.

Hemaglutinační inhibice Principem reakce je inhibice hemaglutinačních účinků antigenu, tj. viru Parainfluenza. Nutnou podmínkou jsou tedy hemaglutinační schopnosti antigenu. Při provedení reakce se nejprve v mikrotitrační destičce vzorek séra (ředěného dvojkovou řadou) či plasmy smísí s antigenem viru Parainfluenza a po inkubaci (1 h, laboratorní teplota) se přidají taninované hovězí erytrocyty. Destička se inkubuje při 4 °C 18 – 20 h. Pokud je v séru dostatečná koncentrace specifických protilátek, tyto se naváží na antigen, a inhibují jeho hemaglutinační schopnosti. Většinou se reakce hodnotí pouze kvalitativně a provádí se v několika ředěních séra. Jako výsledek se udává nejvyšší ředění séra (1:10 až 1:1280) dvojkovou řadou (tzv. titr) při kterém ještě nedošlo k hemaglutinaci. Je-li titr < 1:20 je reakce považována za negativní. Popsaná reakce je tzv. přímou reakcí inhibice hemaglutinace. Při testu se nerozlišují protilátky IgG a IgM.

Nepřímá imunofluorescence IgG Do jamek destiček s ukotveným antigenem Parainfluenza byla pipetována analyzovaná séra (naředěná fosfátovým pufrem). Po inkubaci 30 min při 20 – 25 °C vypláchnutí a promývání (2x) byl přidán konjugát fluorescein izotiokyanátu s kozí protilátkou vůči lidskému IgG. Následovala další inkubace 30 min při 20 – 25 °C. Pak byly vzorky promyty (2x), vysušeny a překryty glycerolovým médiem s fosfátovým pufrem a analyzovány ve fluorescenčním mikroskopu. Vzorky bez fluorescence jsou negativní, s titrem 1:10 nepřímé fluorescence (excitace 488 nm, emise 530 nm) na 1+ jsou nejasné a s titrem 1:10 a fluorescencí > 1 jsou pozitivní (titr 1:320 je akutní infekce). Senzitivita: 100 %. Hemolytické, lipemické a ikterické vzorky nevykazují žádné interference do koncentrací 5 g Hb/l, 22,6 mmol/l TAG a 684 µmol/l bilirubinu.

Nepřímá imunofluorescence IgM Pro průkaz IgM protilátek je třeba sérum upravit reakcí se sorbentem (kozí protilátkou vůči lidskému IgG). Do jamek destiček s ukotveným antigenem Parainfluenza byla pipetována analyzovaná séra (naředěná fosfátovým pufrem). Po inkubaci 30 min při 20 – 25 °C vypláchnutí a promývání (2x) byl přidán konjugát fluorescein izotiokyanátu s kozí protilátkou vůči lidskému IgM. Následovala další inkubace 30 min při 20 – 25 °C. Pak byly vzorky promyty (2x), vysušeny a překryty glycerolovým médiem s fosfátovým pufrem a analyzovány ve fluorescenčním mikroskopu. Vzorky bez fluorescence jsou negativní, s titrem 1:10 nepřímé fluorescence (excitace 488 nm, emise 530 nm) na 1+ jsou nejasné a s titrem 1:10 a fluorescencí > 1 jsou pozitivní (titr 1:320 je akutní infekce). Hemolytické, lipemické a ikterické vzorky nevykazují žádné interference do koncentrací 5 g Hb/l, 22,6 mmol/l TAG a 684 µmol/l bilirubinu.

ELISA IgG umožňuje in vitro semikvantitativní nebo kvantitativní vyšetření na protilátky třídy IgG vůči antigenům Parainfluenza v séru nebo plazmě. Reakční jamky mikrotitračních destiček jsou potažené antigenem Parainfluenza viru. V prvním kroku reakce jsou zředěné vzorky sér inkubovány v jamkách 60 min při 37 °C. V případě pozitivního vzorku se specifické IgG protilátky (také IgM a IgA) váží k antigenům. Po promytí pufrem (3x) se k detekci navázaných protilátek provádí následně inkubace 30 min za laboratorní teploty ve tmě s enzymovým konjugátem (protilátka vůči lidskému IgG značená peroxidázou), který je schopen vyvolat barevnou reakci, následně po promytí pufrem (3x), s přidaným tetrametylbenzidinem a H₂O₂. Po 15 min ve tmě se reakce zastaví 0,2 M H₂SO₄ a intenzita vzniklého zabarvení je přímo úměrná koncentraci IgG protilátek proti antigenům Parainfluenza virů. Měření se provádí při 450/620 nm do 30 min. Semikvantitativní výsledky jsou hodnoceny v poměru k absorbanci cutoff kalibrátoru tak, že výsledky < 0,9 jsou negativní; 0,9 až 1,1 jsou hraniční a > 1,1 jsou pozitivní. Na základě čtyř standardů je možné i kvantitativní hodnocení v arbitrárních jednotkách kU/l. Analytická citlivost 1,04 kU/l. Přesnost v sérii 1,6 – 6,8 %, mezi sériemi 9,8 %. Senzitivita: > 95 %, specifita: > 95 %. Hemolytické, lipemické a ikterické vzorky nevykazují žádné interference do koncentrací 10 g Hb/l, 5,6 mmol/l TAG a 342 µmol/l bilirubinu.

ELISA IgM umožňuje in vitro semikvantitativní nebo kvantitativní vyšetření na protilátky třídy IgM vůči antigenům Parainfluenza v séru nebo plazmě. Reakční jamky mikrotitračních destiček jsou potažené antigenem Parainfluenza viru. V prvním kroku reakce jsou zředěné vzorky sér inkubovány v jamkách 60 min za laboratorní teploty. V případě pozitivního vzorku se specifické IgM protilátky (také IgG a IgA) váží k antigenům. Po promytí pufrem (3x) se k detekci navázaných protilátek provádí následně inkubace 30 min za laboratorní teploty s enzymovým konjugátem (králičí protilátka vůči lidskému IgM značená peroxidázou), který je schopen vyvolat barevnou reakci, následně po promytí pufrem (3x), s přidaným tetrametylbenzidinem a H₂O₂. Po 20 min ve tmě se reakce zastaví 0,5 M H₂SO₄ a intenzita vzniklého zabarvení je přímo úměrná koncentraci IgM protilátek proti antigenům Parainfluenza virů. Měření se provádí při 450/620 nm do 60 min. Semikvantitativní výsledky jsou hodnoceny v poměru k absorbanci cutoff kalibrátoru tak, že výsledky < 0,8 jsou negativní; 0,8 až 1,2 jsou hraniční a > 1,2 jsou pozitivní. Na základě čtyř standardů je možné i kvantitativní hodnocení v arbitrárních jednotkách kU/l. Analytická citlivost 1,18 kU/l. Přesnost v sérii 8,3 %, mezi sériemi 8,9 %, linearita ředění 67 – 126 %, zpětný výtěžek 87 – 104 %. Senzitivita: 100 %, specifita: 100 %. Hemolytické, lipemické a ikterické vzorky nevykazují žádné interference do koncentrací 8 g Hb/l, 5,6 mmol/l TAG a 513 µmol/l bilirubinu.

ELISA IgA umožňuje in vitro semikvantitativní nebo kvantitativní vyšetření na protilátky třídy IgA vůči antigenům Parainfluenza v séru nebo plazmě. Reakční jamky mikrotitračních destiček jsou potažené antigenem Parainfluenza viru. V prvním kroku reakce jsou zředěné vzorky sér inkubovány v jamkách 60 min za laboratorní teploty. V případě pozitivního vzorku se specifické IgA protilátky (také IgG a IgM) váží k antigenům. Po promytí pufrem (3x) se k detekci navázaných protilátek provádí následně inkubace 30 min za laboratorní teploty s enzymovým konjugátem (králičí protilátka vůči lidskému IgA značená peroxidázou), který je schopen vyvolat barevnou reakci, následně po promytí pufrem (3x), s přidaným tetrametylbenzidinem a H₂O₂. Po 20 min ve tmě se reakce zastaví 0,5 M H₂SO₄ a intenzita vzniklého zabarvení je přímo úměrná koncentraci IgA protilátek proti antigenům Parainfluenza virů. Měření se provádí při 450/620 nm do 60 min. Semikvantitativní výsledky jsou hodnoceny v poměru k absorbanci cutoff kalibrátoru tak, že výsledky < 0,8 jsou negativní; 0,8 až 1,2 jsou hraniční a > 1,2 jsou pozitivní. Na základě čtyř standardů je možné i kvantitativní hodnocení v arbitrárních jednotkách kU/l. Analytická citlivost 0,96 kU/l. Přesnost v sérii 7,6 %, mezi sériemi 7,7 %, linearita ředění 79 – 105 %, zpětný výtěžek 94 – 106 %. Senzitivita: 100 %, specifita: 99 %. Hemolytické, lipemické a ikterické vzorky nevykazují žádné interference do koncentrací 8 g Hb/l, 5,6 mmol/l TAG a 513 µmol/l bilirubinu.

V dostupné literatuře nejsou uvedené.