APC rezistence, FV Leiden

Vyšetření se provádí z citrátové plazmy chudé na destičky, která se získá odběrem žilní krve do zkumavky s citrátem sodným v poměru 1 díl citrátu + 9 dílů krve. Koncentrace citrátu se doporučuje v rozmezí 0,105 až 0,109 mol/l. Při venepunkci je doporučeno používat jehlu o průměru 0,7 až 1,0 mm (tenčí jehly mohou způsobit hemolýzu a předčasnou aktivaci destiček a koagulačních faktorů) a je nutné vyvarovat se použití škrtidla déle než 1 min. Doprava materiálu do laboratoře do 2 h. Stabilita plazmy je dle doporučení ČHS 4 h při 15 – 25 °C. Při léčbě heparinem se doporučuje oddělit plazmu do 30 min; vzorek se centrifuguje 10 min při 1800 až 2500 g, nejlépe dle doporučení výrobce odběrového systému.

V případě zamrazení plazmy volíme dvojitou centrifugaci a oddělujeme plazmu 0,5-1,0 cm nad suspenzí erytrocytů, jelikož trombocyty obsahuji FV. Plazmu lze skladovat 4 týdny při -20 °C nebo 6 měsíců při -70°C . Pro následné zpracování zmrazené plazmy je nutno plazmu rozmrazovat po dobu cca 5 min ve vodní lázni cca 37 °C, šetrně promíchat a ihned provést měření. Rozmražené vzorky plazmy nelze opakovaně zamrazovat.

Rezistence na aktivovaný protein C byla poprvé popsaná v roce 1995. V přibližně 95% případů je způsobená Leidenskou mutací FV (faktor V), tzv. FV Leiden (FVL), která vzniká bodovou mutací v genu pro FV čím dojde k záměně argininu v poloze 506 za glutamin, táto molekula je pak odolná vůči štěpení aktivovaným proteinem C. APC rezistence je spojená s trombofílii, a to nezávisle na přítomnosti FVL. Pro screening  APCR bylo vyvinuto několik testů, z kterých některé jsou specifické pro detekci mutace FV a to začleněním FV deficitní plazmy.

Metoda na bázi aPTT – původní test ve kterém se měří aPTT vzorku po přidání aktivovaného proteinu C. V přítomnosti FVL je prodloužení doby srážení menší. Test se provádí ve dvou zkumavkách a to bez přidání APC a s APC. Výsledek se uvádí jako poměr (aPTT s APC)/(aPTT bez APC). Nositelé mutace FVL mají obvyklé tento poměr < 2; nicméně část jedinců s heterozygotní mutací se může dostat do oblasti s poměrem > 2,0. U tohoto testu je limitující to, že pacient nesmí mít výrazně prodloužený aPTT. Pro zlepšení diskriminace mezi heterozygoty FVL a jednotlivci bez mutace, byl poměr výsledků měřeného vzorku vydělen poměrem normálního vzorku, kde 100 % pacientů s poměrem menším než 0,70 byli heterozygoti nebo homozygoti pro mutaci FV.

Metoda s přídavkem FV deficitní plazmy – je to modifikace původního testu, kde vyšetřovaná plazma se nejdříve naředí FV deficitní plazmou, čím dosáhneme normalizaci ostatních faktorů. Test je vysoce specifický pro mutace FV, nicméně přítomnost lupus antikoagulans může způsobit prodloužení aPTT, což je hlavním zdrojem falešně pozitivních výsledků. Některé testy můžou obsahovat polybren, čímž se stávají použitelné i při léčbě heparinem.

Nejmodernější test je APC-R faktor V Leiden – vyšetřovaný vzorek se naředí s FV deficitní plazmou a pak je vyšetřovaný jak s přídavkem APC, tak bez něj. Metoda se liší od ostatních tím, že obsahuje specifický aktivátor FV, izolovaný z hadího jedu (RVV-V z Daboia russelli). A koagulace se aktivuje pomocí protrombinového aktivátoru noscarinu, který je izolovaný z hadího jedu (Notechis scutatus scutatus), a jehož aktivita je závislá na FVa. Test je vysoce specifický a označuje se jako PCR-like. Není ovlivněn abnormitami v ostatních faktorech, proteinu C, proteinu S, dokonce ani přítomnosti LA (lupus antikoagulans) a heparinu (obsahuje heparinový neutralizátor).

Chromogenní test – test pro detekci APCR založený na schopnosti zamezit aktivaci FX, tím že APC inaktivuje FVIIIa v plazmě. FXa se následně stanoví chromogenní metodou. Poměr FXa ve vzorku bez APC a s APC odráží reakci koagulačního systému v plazmě na APC. 
Metoda je zahrnutá v EHK – pozor na způsob udávání výsledků!

jsou závislé na typu testu.

APCR je negativní – nízké hladiny FV, špatný odběr.

APCR je pozitivní – akutní fáze, vysoká hladina FVIII, hormonální antikoncepce, lupus antikoagulans, těhotenství, antikoagulační léčba, vyšší počet trombocytů v plazmě.