Antibody to Hepatitis E, Antibody to HEV, HEV Antibody

Stanovení se provádí v séru (pokud se použije plazma, doporučuje se jako antikoagulans citrát). Stabilita při 4 – 8 °C 2 – 7 d, při -20 °C dlouhodobě.

Všechny analytické postupy jsou kvalitativní.

ELISA sendvičového typu probíhá tak, že jamky mikrotitračních destiček jsou potažené HEV s více epitopy syntetického peptidu a rekombinantním antigenem. Přidá se vzorek séra s diluentem a inkubuje se 30 min při 37 °C. Pak se promytím (5x) oddělí volné protilátky a přidá se konjugát HEV s křenovou peroxidázou a inkubuje se 20 min při 37 °C. Nenavázaný enzymový konjugát se odstraní promytím (5x), přidá se tetrametylbenzidin, H₂O₂ a urea a inkubuje se 10 min při 37 °C. Vývoj modrého zbarvení odpovídá množství anti-HEV. Reakce se zastaví 1 M H₂SO₄, zbarvení se změní na žluté a hodnotí se fotometricky při 450 nm. Cutoff se určí jako absorbance průměru negativních kontrol + 0,15. Nereaktivní výsledky na anti-HEV < cutoff, reaktivní ≥ cutoff. Nelze použít silně hemolytické, lipemické a zakalené vzorky. Opakované zamrazování a rozmrazování se nedoporučuje.

V případě, že se prokazuje pouze anti-HEV IgG, pak konjugát obsahuje monoklonální myší protilátku vůči lidskému IgG s křenovou peroxidázou. V tomto případě se určuje cutoff jako absorbance průměru negativních kontrol + 0,2.   

Western blot probíhá tak, že rekombinantní ORF₂ polypeptidy, obsahující aminokyseliny 459 – 607, 472 – 607 a 459 – 594 jsou separovány na polyakrylamidovém gelu s příměsí 12 % laurylsíranu sodného a přeneseny na polyvinyliden-difluoridovou membránu. Membrána je blokována 1 h sbíraným 5 % mlékem v 0,05 % Tween 20 ve fosfátovém pufru při laboratorní teplotě a pak je rozřezána pro 3 vzorky. První je inkubován 1 h s 1000x ředěným a POD značeným anti-His₆ (obsahuje alespoň 6 molekul histidinu). Ostatní jsou inkubovány 3 h se vzorky 100x ředěnými 5 % sbíraným mlékem. Po čtyřech promytích se přidá 2000 x ředěný konjugát protilátky vůči lidskému IgG nebo IgM s křenovou peroxidázou a membrána se inkubuje 1 h, aby bylo možné detekovat navázané protilátky. Vizualizace se provádí reakcí s 3,3´-diaminobenzidinem.

Někteří jedinci nevytváří protilátky vůči hepatitidě E. Pozitivní anti-HEV IgM zůstávají u 50 % pacientů až 3 měsíce.