Parathyrodní hormon, PTH, i-PTH, parathyrin, intaktní parathyrin

Stanovení se provádí v plazmě nebo séru. Odběr provádět do vychlazené zkumavky, transport do laboratoře v ledové lázni (lze také odstředit v chlazené centrifuze a dopravovat zmrazenou plazmu). Opakované zmrazování a rozmrazování strukturu hormonu poškozuje. K separaci séra nebo plazmy použít chlazenou centrifugu a udržovat teplotu do 8 °C. Vzorky nelze stabilizovat azidem sodným. Stabilita v plazmě nebo séru při 2 – 8 °C 2 dny, při -20 °C 25 týdnů.

Kompetitivní RIA postup nebyl dostatečně citlivý a specifický. Mnohem úspěšnější jsou sendvičové postupy s různými markery. Obvykle se používá protilátka vůči PTH (sekvence 39-84, 44-84 nebo 74-84) zakotvená (kovalentně nebo nekovalentně) na pevné fázi. Druhá protilátka vůči PTH (sekvence 1-34) se značkou může být přidávaná současně se vzorkem. Stanovení intaktního PTH je diagnosticky důležitější, protože je na rozdíl od fragmentů biologicky aktivní.

IRMA sendvičového typu používá dvě protilátky vůči různým epitopům PTH. Zkumavka je potažena kotvící polyklonální protilátkou vůči PTH, pak se přidá standard nebo vzorek. Po inkubaci a odsátí se přidá monoklonální protilátka značená ¹²⁵I. Po další inkubaci, odsátí a dvojnásobném promytí se měří signál gama-počítačem. Rozsah měření po šestibodové kalibraci je do 274 pmol/l. Analytická citlivost je 0,2 pmol/l. Preciznost v sérii je ≤ 7,7 %, mezi sériemi ≤ 10,3 %. Linearita ředění je 98 – 121 %, zpětný výtěžek 91 -110 %. Rozsah měření je 0,2 – 263 pmol/l. Heterofilní protilátky v lidském séru/plazmě mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým stanovením.

ELISA v sendvičovém uspořádání probíhá v mikrotitrační destičce se zakotvenou polyklonální kozí protilátkou vůči fragmentu 1-34 PTH. Do jamky se přidá standard nebo vzorek a po inkubaci a promytí myší monoklonální protilátka vůči fragmentu 44-68 PTH s navázanou křenovou peroxidázou. Po další inkubaci a promytí se přidá chromogen tetrametylbenzidin a reakce probíhající ve tmě je zastavena stop činidlem. Měření při 450 nm nutno provést do 1 h. Celý postup se realizuje za laboratorní teploty. Citlivost metody je 0,21 pmol/l.

Jiná ELISA používá dvou polyklonálních kozích protilátek vůči fragmentům 1-34 (tato Ab je značená křenovou peroxidázou) a 39-84 (tato Ab má biotinylovou kotvu) PTH. Mikrotitrační jamky jsou potaženy streptavidinem. Po inkubaci 3 h a pětinásobném propláchnutí se přidá substrát tetrametylbenzidin a inkubuje se 30 min ve tmě. Pak se přidá stop činidlo (2M H₂SO₄) a měří se do 10 min bichromaticky při 450/405 nm. Celý postup se realizuje za laboratorní teploty. Šestibodová kalibrace umožňuje měření v intervalu 0,16 – 74 pmol/l se zpětným výtěžkem 95 – 109 %. Linearita ředění je 84 – 109 %. Preciznost v sérii 3,7 – 6,1 %, mezi sériemi 2,8 – 3,6 %. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 221 nmol/l. Zbytky polyesterové pryskyřice snižují aktivitu křenové peroxidázy.

Chemiluminiscenční imunoanalýza v sendvičovém uspořádání používá kozí polyklonální protilátku vůči intaktnímu PTH, zakotvenou na paramagnetických částicích ke které se přidává ředěný standard nebo vzorek. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá kozí polyklonální protilátka vůči PTH značená akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je přímo úměrná koncentraci i-PTH a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Metoda dovoluje měřit vzorky v rozmezí koncentrací 0,32 – 316 pmol/l (vyšší koncentrace se ředí 2x). Preciznost v sérii 2,9 – 6,1 %, celkově 3,0 – 6,4 %. Zpětný výtěžek je 101 %, linearita 97 – 103 %. Funkční senzitivita (CV ≤ 20 %) je 0,32 pmol/l, analytická senzitivita (nulový blank) 0,024 pmol/l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší.

Podobný princip zábleskové luminiscence lze použít s esterem akridinu jako značkou. První protilátka je polyklonální kozí vůči lidskému PTH (N-terminální 1-34) značená esterem akridinu. Druhá protilátka je biotinylovaná polyklonální kozí vůči PTH (39-84 oblast). Obě protilátky se pipetují současně bezprostředně po vzorku a pak se 6 min roztok inkubuje. Přidají se paramagnetické latexové částice (streptavidin je kovalentně na ně vázáný) a opět se inkubuje 3 min. Po odsátí roztoku a promytí zkumavek se přidá peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk fotonásobičem při 429 nm. Vzorky s koncentrací PTH > 200 pmol/l se ředí 5x. Analytická citlivost je 0,265 pmol/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 10,6 nmol/l. Preciznost v sérii 1,4 – 4,3 %, mezi sériemi 1,9 – 7,3 %. Linearita ředění je 88,9 – 105,8 %, zpětný výtěžek 91,0 – 123,6 %. Heterofilní protilátky v lidském séru/plazmě mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým stanovením.

CLIA je dvoustupňové sendvičové stanovení. Vzorek se inkubuje 10 min s reakčním pufrem a polyklonální protilátkou konjugovanou s izoluminolem s vysokou afinitou vůči části 1-34 molekuly 1-84 PTH. Po inkubaci jsou do reakce přidány paramagnetické částice potažené druhou monoklonální protilátkou, která má tendenci se vázat na C-terminální část (39-84) molekuly 1-84 PTH a inkubují se 10 min. Po promytí je přidán startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je přímo úměrná hladině PTH. Rozsah měření na základě dvoubodové kalibrace je 0,4 – 212 nmol/l. Analytická citlivost je 0,21 nmol/l, funkční citlivost 0,42 nmol/l. Efekt nadbytku antigenu do 26500 nmol/l nebyl pozorován. Preciznost v sérii 2,3 – 8,0 %, mezi sériemi 3,4 – 13,7 %; zpětný výtěžek 89 – 108 %. Hemolýza, lipémie a ikterus ruší.

Jiné stanovení je založeno na sekvenční imunochemické reakci. PTH se v prostředí pufrovaného roztoku váže jedním epitopem na polyklonální kozí protilátku imobilizovanou na polystyrenové kuličce. Reakce probíhá 30 minut při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí reaguje druhý epitop PTH s polyklonální kozí protilátkou konjugovanou s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 minut při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se ihned rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita vzniklého záření 425 – 500 nm je přímo úměrná koncentraci celého PTH ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Vzorky s koncentrací PTH vyšší než 263 pmol/l se ředí 10x. Funkční citlivost (CV £ 20 %) je 0,1 pmol/l. Preciznost v sérii (227,4 pmol/l) < 7,1 %, v čase (28,7 pmol/l) < 5,6 %, zpětný výtěžek 92 -110 %. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 105,3 nmol/l. Fragment PTH 7-84 vykazuje křížovou reaktivitu přibližně 80 %. Hemolýza a bilirubin zapříčiňují snížení naměřených hodnot. Rovněž ruší lipémie.

Jiný postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530. Do zkumavky se pipetuje monoklonální protilátka vůči intaktnímu PTH značená ALP a standard nebo vzorek. Pak se přidají paramagnetické částice potažené kozí polyklonální protilátkou vůči PTH. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky a přidá se chemiluminiscenční substrát. Rozsah měření při 470 nm je 0,1 – 371 pmol/l (po ředění 3174 pmol/l). Analytická citlivost 0,1 pmol/l. Funkční citlivost (CV ≤ 20 %) je 0,4 pmol/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 26,5 nmol/l. Linearita ředění je 73 – 105 %. Preciznost v sérii 1,6 – 2,6 %, mezi sériemi 2,8 – 5,8 %.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou(ECLIA) v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (50 µl) je inkubován s biotinylovanou monoklonální myší protilátkou vůči PTH a monoklonální myší protilátkou vůči PTH značenou ruthéniovým komplexem za vzniku sendvičové formace. Pak se přidají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem a celý komplex je vázán na pevnou fázi pomocí biotin-streptavidinové kotvy. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Luminiscence je přímo úměrná koncentraci parathormonu ve vzorku. Hemoglobin > 1,5 g/l ovlivňuje stanovení, chylozita, ikterus a RF (< 1500 kIU/l) neruší. Od pacientů léčených vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměly odebírat vzorky dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Metoda je použitelná v rozsahu 0,127 – 530 pmol/l. Vyšší koncentrace se ředí 5x. Funkční citlivost (CV ≤ 20 %) je 0,64 pmol/l. Reprodukovatelnost v sérii CV 1,1 – 2,7 %, mezi sériemi 2,8 – 6,5 %. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 1802 pmol/l. Ruší velmi vysoké hodnoty protilátek vůči streptavidinu a rutheniu.

Toleranční limit EHK: 23 %.

Výsledky snižuje: zvýšená koncentrace EDTA (u metod s ALP značkou), orální zátěž vápníkem, léčba kalcimimetiky, katecholaminy, imobilizace, alkoholismus, vitamin D₃, hemodialýza, ketokyseliny, velký úbytek hmotnosti.

Výsledky zvyšuje: tělesná zátěž (až o 90 %), termální trauma, lithium (až o 50 %), furosemid, hemolýza, chylozita, selhání ledvin, léčba kalcilytiky, příjem vysokých dávek fosfátů (až o 125 %) a nedostatek vápníku, dopamin, vegetariánská dieta, heterofilní protilátky.