Apo-Theo La, Aquaphyllin, Asmalix, Bronkodyl, 1,3-dimetylxantin, Elixophyllin, Euphyllin, Phyllocontin,
Quibron-T, Slo-Bid, Slo-Phyllin, Sustaire, Syntophyllin, Theoclear-80, Theobid, Theo-Dur, Theolair, Theosol-80, Theospan, Truphylline, Truxophyllin

1,3-dimethyl-7H-purin-2,6-dion

Poznámka: aminofylin není teofylin, ale směs teofylinu, etylendiaminu a krystalické vody

Odběr 2 h po podání a před následující dávkou. Vzorek transportovat v chladu a nemrazit. Stanovení se provádí v séru popřípadě v plazmě (antikoagulans heparin, použití K₂EDTA, NaF nebo šťavelanu draselného se nedoporučuje, protože mohou interferovat při analýze) nebo i plné krvi. Je možné také provádět vyšetření
ve slinách (obvykle pomocí HPLC), přičemž pacient žvýká parafinový vosk. Plná krev obsahuje 82 % koncentrace teofylinu ve srovnání se sérem nebo plazmou. Při skladování vzorku do 48 h nebyl pozorován rozdíl mezi použitím separačního gelu nebo jeho absencí. Stanovení ovlivňuje věk, kouření, kofeiny a taniny. Koncentrace v krvi závisí také na lékové formě a způsobu aplikace léku.
Stabilita vzorku 4 – 8 °C: 1 týden. V řadě souprav je uvedeno, že vzorek je možné skladovat při -20 °C
1 – 6 měsíců, ačkoliv se zamrazení nedoporučuje ! Biologický poločas 3 – 9 h.

První metodou stanovení teofylinu byla extrakce do směsi chloroformu s izopropylalkoholem a reextrakce do ředěného hydroxidu sodného. Absorbance vodného extraktu se měřila bichromaticky (277 a 310 nm). Později byla eliminována interference barbituranů. Celková reprodukovatelnost měla CV 4,84 – 6,74 %, výtěžnost byla 87,0 – 93,5 %. Nicméně byl tento postup nahrazen enzymovými a imunoanalytickými metodami, případně HPLC. Tím se zvýšila specifita a rychlost stanovení a snížil se požadovaný objem vzorku.

Metoda nekompetitivní enzymové inhibice vychází z toho, že teofylin je účinný nekompetitivní inhibitor ALP
z hovězích jater. Technologie tenkovrstvého filmu umožňuje využívat tento princip (konverze p-nitrofenylfosfátu na p-nitrofenol pomocí ALP je inhibována teofylinem a množství produktu je nepřímo úměrné stanovovanému léčivu. Není-li teofylin přítomen, je rychlost přeměny substrátu na produkt nejvyšší. Absorbance se měří při
400 nm ve dvou bodech po přidání vzorku. Rozdíl absorbance se používá k určení koncentrace teofylinu na základě kalibrační křivky.
EMIT používá jako značku glukóza-6-fosfátdehydrogenázu a kompetitivní uspořádání homogenní imunochemické reakce. Léčivo ze vzorku a teofylin značený glukóza-6-fosfátdehydrogenázou soutěží o vazebná místa specifické protilátky. Vznik imunokomplexu inhibuje katalytickou aktivitu enzymové značky. Zbytková enzymová aktivita po inkubaci je dána množstvím volného konjugátu a je přímo úměrná množství teofylinu
ve vzorku. Měří se při 340 nm jako rychlost přeměny NAD⁺ na NADH. Rozsah metody 14 – 222 µmol/l, analytická citlivost 4,2 µmol/l. Reprodukovatelnost v sérii dosáhla CV 1,2 – 7,9 %, mezi sériemi 2,9 – 8,4 %.
CEDIA používá β-galaktosidázu geneticky upravenou na dva inaktivní fragmenty (donor a akceptor). Donorová část je navázaná na teofylin (konjugát) a konkuruje s lékem ze vzorku o omezený počet vazebných míst protilátky. Protilátka kryje vazebné místo donoru pro akceptor a proto po přidání volného akceptoru se může vytvořit aktivní enzym jen z volného konjugátu a nikoliv z imunokomplexu. Substrátem pro barevnou detekční reakci je β-D-galaktopyranosid chlorfenolové červeně a uvolněné barvivo se sleduje při 575 nm. Nárůst absorbance chlorfenolové červeně je přímo úměrný koncentraci teofylinu (dvoubodová kalibrace). Analytická citlivost metody je 4,4 µmol/l. Rozsah měření je do 222 µmol/l. Reprodukovatelnost v sérii CV 1,3 – 3,3 %, celkem 2,0 – 5,1 %. Odezva na linearitu je 93,6 – 102,1 %, výtěžnost 100 – 107 %. Při stanovení interferuje kyselina dimetylmočová.
Enzymová inhibiční imunoanalýza je v kompetitivním uspořádání a umožňuje stanovení v séru, plazmě i plné krvi. Konjugát léčiva s inhibitorem enzymu soutěží s teofylinem ze vzorku o volná místa na protilátce. Protilátka vázaná na konjugát zabraňuje inhibici acetylcholinesterázy, takže množství produktu měřené fotometricky je přímo úměrné koncentraci teofylinu. Acetylcholinesteráza hydrolyzuje acetyl-β-(metylthio)cholinjodid na volný thiol, který reaguje s 5,5´-dithiobis(2-nitrobenzoovou kyselinou) na thionitrobenzoát. Rychlost vzniku zbarvení je přímo úměrná koncentraci teofylinu ve vzorku.
Homogenní enzymová imunoanalýza v kompetitivním uspořádání využívá jako značku prostetickou skupinu FAD, která je v imunokomplexu chráněná protilátkou a brání aktivitě GOD. Apo-glukózaoxidáza vyžaduje pro svou aktivitu prostetickou skupinu FAD, která je kovalentně vázaná na teofylin. Vlivem teofylinu ze vzorku se váže méně konjugátu na protilátku a FAD se může uplatnit v enzymové reakci. GOD oxiduje glukózu vzdušným kyslíkem na glukonolakton a současně se kyslík redukuje na peroxid vodíku. V následné reakci peroxid vodíku oxiduje v přítomnosti POD tetrametylbenzidin na barevný produkt. Absorbance při 740 nm je přímo úměrná koncentraci teofylinu ve vzorku. Rozsah metody je do 222 µmol/l. Reprodukovatelnost v sérii měla CV 3,5 –
5,9 %, mezi sériemi 3,3 – 5,0 %; výtěžnost 97 – 110 %.
Kompetitivní ELISA na mikrotitračních destičkách používá křenovou peroxidázu jako marker a po imunoreakci jako substrát tetrametylbenzidin.
Fluorescein jako marker se používá při homogenní fluorescenční polarizační imunoanalýze (FPIA).
V kompetitivním uspořádání má značené léčivo v imunokomplexu s myší monoklonální protilátkou vyšší polarizovanou fluorescenci než volný konjugát. Emitovaná polarizovaná fluorescence je nepřímo úměrná koncentraci léčiva ve vzorku. Citlivost metody je 4,55 µmol/l. Rozsah metody je do 222 µmol/l, vyšší koncentrace lze ředit automaticky. Reprodukovatelnost CV v sérii je 1,7 – 2,5 %, mezi dny 0,4 – 0,8 %, celkem 1,9 – 2,6 %. výtěžnost 95,9 – 98,1 %. Při analýze interferuje 3-metylxantin.
Fluorimetrická imunoanalýza zesílená enzymem je v kompetitivním uspořádání, kde teofylin ze vzorku a teofylin značený enzymem (bakteriální ALP) soutěží o protilátku zakotvenou na povrchu skleněného vlákna. Po vymytí nenavázaného podílu se přidá substrát (4-metylumbeliferylfosfát) a vznikající 4-metylumbeliferon se měří fluorimetrem. Pokud není ve vzorku teofylin, dosáhne se nejvyššího signálu fluorescence, protože se na imobilizovanou protilátku v reakční zóně naváže maximální množství teofylinu s ALP. Reprodukovatelnost mezi dny měla CV 5,8 %, výtěžnost byla 84 – 107 %.
Kompetitivní chemiluminiscence s esterem akridinu jako značkou je metoda při které soutěží teofylin ze vzorku se značeným teofylinem 7,5 min. o omezený počet vazebných míst na myší monoklonální protilátce, která je vázaná na kotvící myší monoklonální protilátku kovalentně zachycenou na paramagnetické částice. Volná frakce je odstraněna promytím a přidá se peroxid vodíku a roztok hydroxidu sodného. Vzniklá luminiscence (detekovaná při 400 nm) je nepřímo úměrná koncentraci teofylinu ve vzorku. Rozsah metody je 2,2 –
222 µmol/l. Analytická citlivost je 2,8 µmol/l. Odezva na ředění byla 90,2 – 109,9 %, výtěžnost 88,2 – 105,4 %. Reprodukovatelnost v sérii CV 3,7 – 5,3 %, mezi sériemi 0,8 – 3,3 %, celkem 6,1 – 9,6 %. Nejistota byla 10,7 – 19,5 %.
LIA stanovení s využitím volného substrátu je založeno na kompetitivní imunochemické reakci. Na polystyrénové kuličce v reagenční zkumavce je navázána králičí polyklonální protilátka proti teofylinu. Kulička se inkubuje 30 minut se vzorkem a alkalickou fosfatázou značeným teofylinem, kdy dochází ke konkurenční reakci. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetan-fenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se ihned rozpadá za vzniku záření 477 nm, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření je nepřímo úměrná koncentraci teofylinu ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané
z čárového kódu činidla. Rozsah metody je 5,5 – 333 µmol/l. Analytická citlivost 1,7 µmol/l. Preciznost v sérii
4,1 – 12,1 %, celkově 5,9 – 13,4 %; odezva na ředění 94 – 120 %, výtěžnost: 91 - 105 %.
Chemiluminiscenční imunoanalýza na mikročásticích (CMIA) je jednostupňová metoda. Vzorek se smíchá
s paramagnetickými mikročásticemi potaženými kozími protilátkami vůči myším protilátkám proti teofylinu
a s konjugátem teofylinu s akridinem. Po inkubaci a promytí se přidají roztoky peroxidu vodíku a hydroxidu sodného. Výsledná chemiluminiscenční reakce je nepřímo úměrná koncentraci teofylinu ve vzorku. Rozsah metody do 222 µmol/l, vyšší koncentrace nutno ředit manuálně. Citlivost metody je 0,28 µmol/l. Reprodukovatelnost v sérii má CV 3,2 – 4,1 % a celkově 4,6 – 7,0 %. Odezva na linearitu 99 – 108 %, výtěžnost 94,3 – 104,6 %.
Turbidimetrická inhibiční imunoanalýza zesílená latexovými částicemi (particle enhanced turbidimetric inhibition immunoassay PETINIA) je homogenní postup, kdy léčivo značené částicemi soutěží s teofylinem
ze vzorku o vazebná místa myší monoklonální protilátky. Rychlost agregace je nepřímo úměrná množství volného teofylinu, protože jen konjugát léčiva s latexem po navázání na protilátku tvoří agregáty. Zákal se měří turbidimetricky při 340 nm nebo při 600 nm. Rozsah měření 11 – 222 µmol/l. Analytická citlivost je 5,6 µmol/l. Preciznost v sérii dosáhla CV 1,3 – 6,1 %, mezi sériemi 1,6 – 8,9 %. Triacylglyceroly 33,9 mmol/l snižují výsledky o 23,7 %.
Metoda KIMS je založena na kinetické interakci mikročástic v roztoku. Protilátka proti teofylinu je kovalentně vázána na mikročástice a derivát léčiva je připojen k makromolekule. Kinetická interakce mikročástic v roztoku je vyvolána vazbou konjugátu léčiva na protilátku na mikročástici a je inhibována přítomností teofylinu ve vzorku. Kompetitivní reakce probíhá mezi konjugátem léčiva a teofylinem ze séra vzorku o vazebná místa protilátky proti teofylinu, navázané na mikročástice. Výsledná kinetická interakce je nepřímo úměrná množství léčiva ve vzorku. Rozsah měření 3,3 – 222 µmol/l (vyšší hodnoty ředit 1+1 dilučním roztokem). Mez detekce je 3,3 µmol/l. Preciznost v sérii CV 0,5 – 1,0 %, mezi sériemi 1,7 – 2,1 %. Výtěžnost 90 – 110 %, odezva na linearitu 97,3 – 110,0 %. Křížová reaktivita aminofylin 79,6 %, 8-chlorteofylin 6,0 %, 1,7-dimetylxantin 5,2 %, 3-metylxantin
2,7 %, efedrin 1 %.
Kinetická nefelometrická inhibiční imunoanalýza (NIIA) je v kompetitivním uspořádání. Konjugát haptenu
s vysokomolekulární bílkovinou soutěží s léčivem ze vzorku o vazebná místa na protilátce. Imunokomplex
s konjugátem je nerozpustný a zvyšuje rozptyl světla, takže rychlost růstu nefelometrického signálu je nepřímo úměrná koncentraci léčiva ve vzorku. Při této nefelometrii se používá dvoubodová kalibrace. Reprodukovatelnost mezi dny měla CV 4,5 %, výtěžnost 97 – 104 %.

GLC stanovení předchází extrakce analytu do chloroformu nebo směsi chloroform-izopropylalkohol a jeho derivatizace alkylací. Jako vnitřní standard se používá 3-izopropyl-1-metylxantin. Po nástřiku na kolonu 3 %
OV-17 se používá plameno-ionizační detektor nebo MS detektor. Postup je poměrně složitý a časově náročný, takže se nehodí pro rutinní analýzu. Celková reprodukovatelnost měla CV 4,74 – 9,42 %, výtěžnost 80,3 –
88,0 %.
GC/MS metoda používá jako vnitřní standard [1,3-¹⁵N, 2-¹³C]teofylin, který je spolu se vzorkem extrahován při pH 5,2 do směsi chloroform-izopropylalkohol. Extrakt se derivatizuje s jódpentanem v alkalickém prostředí
10 min. Po GC separaci se MS detektorem monitorují ionty m/z 250 teofylin a m/z 253 vnitřní standard. Poměr těchto iontů se vynáší proti standardům teofylinu. Bylo dosaženo preciznosti v sérii CV 0,37 – 0,96 %, celková preciznost byla 1,16 %; přesnost byla < 2,1 %; detekční limit metody je 55,5 nmol/l a rozsah měření do
160 µmol/l. Metoda je doporučená jako referenční postup.
HPLC se používá pro analýzu v séru po deproteinaci a extrakci nebo bez extrakce s rozdělením na koloně C₁₈ na obrácené fázi (acetonitril) s retenčním časem méně než 10 min. Fotometrická detekce se provádí při
254 nm. Na oktadecylsilanové koloně lze použít také jako mobilní fázi metanol s vodnými roztoky solí. U metod nepoužívajících extrakce (postačuje 10 µl séra) je někdy velký variační koeficient mezi sériemi. Většina postupů používá jako vnitřní standard 8-chlorteofylin nebo 8-hydroxyteofylin a koncentrace teofylinu se počítá porovnáním výšky nebo plochy píku. Interference ampicilinu, cefalosporinů a methicilinu lze eliminovat extrakcí. Chloramfenikol a některé cefalosporiny mohou interferovat i po extrakci. HPLC je často používaná jako referenční metoda a je také poměrně levná. Celková reprodukovatelnost je CV 2,26 – 3,56 %; výtěžnost 94,0 -100,5 %.
LC/MS/MS postup používal jako standard teofylin s ¹⁵N v poloze 1 a 3. Extrakčním činidlem byl metanol. Teofylin se lépe stanovoval při pozitivní ionizaci, zatímco jeho metabolity v negativním módu. Pro teofylin se sledoval m/z 179→164. Rozsah metody je 0,35 – 111 µmol/l. Analytická citlivost byla 0,15 µmol/l, funkční citlivost 0,35 µmol/l. Reprodukovatelnost v sérii měla CV 1,6 % a mezi dny 7,4 %.

Standardní referenční materiál pochází z NIST (National Institute of Standards and Technology), nese označení SRM 2384 a je společný pro teofylin, teobromin a kofein.

Podle přehledu College of American Pathologists (2002) je preciznost stanovení teofylinu při koncentraci
72 µmol/l 4 – 8 %, jinde do 11 %. Přípustné vychýlení od průměru skupiny podle CLIA-88 (Clinical Laboratory Improvement Amendments) je ±25%. Specifita je ohrožena v séru uremiků (reagují také zvýšené koncentrace 1,3-dimetylurátu). Křížová reaktivita s kofeinem (novorozenci) je < 1 %.
Toleranční rozpětí v EKK je 27 %.

Výsledky stanovení teofylinu snižují: felodipin, fenytoin, hemoglobin (> 1,5 g/l), fenobarbital, fenytoin, karbamazepin, kouření, lithium, marihuana, rifampin, aj.
Výsledky stanovení teofylinu zvyšují: aminoglutethimid, amiodaron, adenin, alopurinol, Belomet, bilirubin, cefalosporiny, cimetidin, ciprofloxacin, citronan, disulfiram, EDTA, enoxacin, heparin (800 U/l), erytromycin, chloramfenikol, 8-chlorteofylin, klindamycin, kofein, linkomycin, lipémie, kyselina 1,3-metylmočová,
3-metylxantin, norflexacin, oleandomycin, orální kontraceptiva, perfloxacin, propranolol, ranitidin, šťavelan, Tagamet, troleandomycin, viloxazin, aj.