anti-GAD, GAD65;

anti-ostrůvkové protilátky, protilátky proti cytoplazmě ostrůvkových buněk (ICA), protilátky proti inzulinu (IAA), protilátky proti dekarboxyláze kyseliny glutamové (GADA), anti-GAD65 protilátky, protilátky asociované s inzulinomem-2 (IA-2A), anti-ICA512 protilátky, protilátky proti proteinu podobnému tyrozin-fosfatáze;

GAD65 Islet Cell Antibody; Glutamic Acid Decarboxylase Antibody; 64K Antibody; Anti-GAD Antibodies; AntiGlutamic Acid Decarboxylase Ab; Beta Cell Antibody; GAD65 Antibody; Glutamic Decarboxylase Antibodies; Islet Cell Antibody.

Odebraný vzorek odstředit v chlazené centrifuze. Stabilita protilátek v séru: 2 – 4 h při 20 – 25 °C, 1 – 5 d při 4 – 8 °C, 3 - 12 měsíců při -20 °C. Lze také použít plazmu (antikoagulans EDTA nebo heparin). Je třeba zabránit hemolýze. Ruší lipémie. Nedoporučuje se opakované rozmrazení.

RIA postup začíná imunoreakcí stanovovaných protilátek s glutamátdekarboxylázou, značenou ¹²⁵I (která je v přebytku). Po inkubaci (2 h) se přidá protein A, zakotvený na pevné fázi (granulky) a dochází k precipitaci (1 h). K precipitaci lze použít i protilátku vůči lidskému IgG, ale analýza pak trvá déle. Přidá se pufr, zkumavky se odstředí, supernatant s volnou ¹²⁵I-GAD se odsaje a granulky se měří v gama-počítači. Radioaktivita je přímo úměrná množství protilátek. Rozsah metody na základě šestibodové kalibrace je 1 – 300 kU/l. Citlivost metody je 0,11 kU/l. Preciznost v sérii 3,6 – 3,7 %, mezi sériemi 4,9 – 7,0 %.

ELISA se provádí v mikrotitračních destičkách se zakotveným antigenem. Kalibrátory nebo ředěné vzorky se pipetují do jamek, pak se roztoky inkubují (2 h, 37 °C). Obsah jamek se odsaje. Přidá se druhá protilátka značená křenovou peroxidázou, roztok se inkubuje (1 h, 37 °C) a obsah jamek se odsaje, 5x promyje a vyklepne na filtrační papír. Přidá se substrát tetrametylbenzidin a následuje další inkubace (15 - 25 min, 37 °C) ve tmě. Další krok je přidání stop činidla (ředěná kyselina sírová) a okamžité měření při 450±10 nm. Stanovení se provádí za laboratorní teploty. Sedmibodová kalibrace umožňuje měřit v rozsahu 0(?) – 100 µg/l. Detekční limit je 1,56 µg/l. Preciznost v sérii < 10 %, mezi sériemi < 12 %. Určitý problém je vztah mezi koncentrací (µg/l) a titrem protilátek (kU/l), který není v soupravě definován.

Jiný postup ELISA začíná stejně, ale inkubace kalibrátorů a vzorků je kratší (1 h, třepání). Roztoky se odsají, jamky 3x promyjí a nakonec se destička vyklepne na filtrační papír. Druhý krok je přidání další protilátky s biotinylovou kotvou a následná inkubace (1 h, třepání). Roztoky se odsají, jamky 3x promyjí a nakonec se destička vyklepne na filtrační papír. Třetím krokem je přidání streptavidinu označeného POD a opět inkubace (20 min, třepání). Roztoky se odsají, jamky 3x promyjí a nakonec se destička vyklepne na filtrační papír. Přidá se tetrametylbenzidin a reakce se po 20 min ve tmě zastaví stop činidlem (5 s třepání). Destička se měří při 405 i při 450 nm. Vyšší koncentrace (≥ 200 kU/l) se měří při 405 nm, nižší koncentrace při 450 nm. Analýza se provádí za laboratorní teploty. Rozsah měření při šestibodové kalibraci je 5 – 2000 kU/l. Mez detekce (2 SD nulového blanku) je 0,57 kU/l. Preciznost v sérii 7,3 – 8,5 %. Hemolýza, chylozita a ikterus neruší.

Další varianta ELISA také začíná imunoreakcí stanovovaných protilátek se zakotveným antigenem (inkubace 1 h). Roztoky se odsají, jamky 3x promyjí a nakonec se destička vyklepne na filtrační papír. Pak se přidá druhá protilátka (kozí) značená ALP a inkubujeme 1 h ve tmě. Nakonec se přidá substrát 4-nitrofenylfosfát, inkubujeme 30 min ve tmě a vývoj barevné reakce se zastaví roztokem 1M hydroxidu sodného. Analýza se provádí za laboratorní teploty. Měření se provádí při 405 nm.

Obecně ruší přítomnost heretofilních protilátek.