močovina, diaminmethanal, diaminomethanon, karbamid, karbonyldiamid, karbonyldiamin, BUN (blood urea nitrogen)

urea

Stanovení se provádí v séru, plazmě (antikoagulans heparinát lithný nebo sodný) a moči. Vzorek krve zpracovat do 15 min po odběru. Fluoridy a citronan inhibují ureázovou reakci. Nelze použít heparinát amonný. Separační gely stanovení neovlivňují. Po oddělení krvinek je urea v séru nebo plazmě stabilní při 20 – 25 °C 1 den –
1 týden, 4 – 8 °C 3 dny – 2 týdny, -20 °C 3 – 24 měsíců. Protože urea podléhá bakteriálnímu rozkladu, měly by být před analýzou vzorky plazmy, séra i moče skladovány při 4 – 8 °C. Hodnoty se zvyšují s věkem a při proteinové dietě a infúzi aminokyselin.
Při stanovení v moči je obvyklé ředění 1+20 nebo 1+50. Vzorky moče je vhodné okyselit na pH < 4 (jinde uvedeno pH < 7). Stabilita v moči při 20 – 25 °C 2 dny, 4 – 8 °C 7 – 10 dní, 20 °C 1 – 3 měsíce. Moč je sbíraná do plastových lahví (polystyrén) bez konzervačních látek a po dobu sběru se doporučuje skladovat odběrové nádoby v lednici. Před odlitím vzorku je nutno střádanou moč řádně promíchat, změřit objem s přesností na
10 ml (u velmi malých dětí s přesností na 1 ml); uvést přesně dobu sběru.

Urea se stanovuje většinou nepřímo po převedení na amoniak enzymem ureázou, méně často přímou chemickou reakcí.

Berthelotova reakce převádí amoniak chlornanem na chloramin, který s fenolem dává modrý indofenolový komplex, jehož absorbance se měří při 630 nm. Reakci katalyzuje nitroprusid sodný a může se provádět bez deproteinace nebo s deproteinací. I když je reakce citlivá, má poměrně úzkou oblast linearity. Vzorky moče se před analýzou ředí 10 – 15-krát. Vzorky moče se musí korigovat na přítomnost amoniaku (močový blank bez ureázy), kterého je v moči až 1000-krát více než v séru.
Glutamátdehydrogenázová metoda je nejběžnější pro stanovení urey v séru i moči. Amoniak vzniklý ureázovou reakcí redukuje kyselinu α-ketogulatovou na glutamovou a současně se NADH oxiduje na NAD⁺. Oxidoredukční reakce je katalyzována glutamátdehydrogenázou. Reakce je velmi specifická a rychlá. Sleduje se pokles absorbance při 340 nm. Exogenní amoniak může způsobit falešné zvýšení výsledků. Ale
v kinetickém uspořádání se endogenní amoniak rychle spotřebuje i při stanovení v moči, takže pozdější pokles absorbance je vyvolán jen ureázovou reakcí s ureou. Preciznost reakce dosahuje v séru CV v sérii 0,9 – 1,3 %, celkem 1,8 – 2,0 %; CV v moči ≤ 4,5 %. Běžný postup je lineární do 49,2 mmol/l v séru a 4290 mmol/l v moči.
Americká asociace klinické chemie v roce 1980 navrhla jako referenční metodu pro stanovení v séru metodu
s ureázou a glutamátdehydrogenázou po odbílkování Somogyi činidlem (roztok hydroxidu barnatého a síranu zinečnatého) v manuálním uspořádání. Výtěžnost byla sledována pomocí ¹⁴C urey a dosáhla 100,6 %. Metoda je lineární do 30 mmol/l. Celková preciznost dosáhla CV 0,78 – 2,92 %, pro koncentrace < 10 mmol/l až
4,88 %. Interference > 2 % jsou pouze při koncentraci bilirubinu 1000 µmol/l, hemoglobinu 10 g/l a hydroxyurey
6 mmol/l. Shoda s Berthelotovou metodou je velmi dobrá (y = 1,011x – 0,09), s diacetylmonoximovým postupem už slabší (y = 0,968x + 0,7).

Reakce s diacetylmonoximem je jediná přímá chemická metoda stanovení urey. Metoda není dostatečně specifická a činidlo je jedovaté a korozívní. Dříve ale byla poměrně rozšířená. Diacetylmonoxim nejdříve hydrolyzuje na diacetyl a hydroxylamin. Diacetyl pak kondenzuje s ureou v kyselém prostředí na žlutý diazin, jehož absorbance se sleduje při 550 nm (nebo fluorescence při 415 nm). Zesílení zbarvení a jeho stabilizaci lze dosáhnout buď přímo (thiosemikarbazidem, železitými ionty nebo glukuronolaktonem) nebo nepřímo (eliminací hydroxylaminu persíranem draselným). Stanovení v séru i v moči lze automatizovat a dosáhnout preciznost CV 2,5 – 6,5 % na horní hranici normálního rozmezí. Hlavním problémem této metody je fotosenzitivita a rychlé blednutí zbarvení. Má-li být metoda lineární je nutné poměrně značné ředění vzorku. Při analýze interferují další dusíkaté sloučeniny přítomné v séru. Také látky obsahující ve své struktuře ureové zbytky (citrulin, aloxan, alantoin) dávají barevné produkty. Jsou však obsaženy v séru v nízké koncentraci. Kreatinin a bílkoviny neinterferují, protože jejich chromogeny mají jiné absorpční maxima.
Reakci o-ftalaldehydu s primárními aminy v kyselém prostředí lze také použít ke stanovení urey. Při reakci vzniká izoindolin, který s 8-(4-amino-1-metylamino)-6-metoxychinolinem v kyselém prostředí dává chromofor absorbující při 510 nm. Metoda se používá málo, protože při ní interferují primární aminy.

Konduktometrické stanovení urey je také poměrně často používaný velmi specifický a rychlý postup v séru
i v moči. Nárůst vodivosti se sleduje v kinetickém režimu, aby se eliminoval vliv endogenní konduktivity. Amoniak vzniklý z urey dává s oxidem uhličitým uhličitan amonný a tím vzrůstá vodivost v reakční směsi. Preciznost stanovení dosahuje CV 3,4 %.
Ion-selektivní elektroda monitoruje vznik amoniaku při ureázové reakci a je součástí vybavení některých menších analyzátorů. Ureáza je kovalentně vázaná na pevnou fázi matrice zakotvené na elektrodě. Detekce se provádí potenciometricky, je velmi specifická a používá se v elektrochemických analyzátorech.

Suchá chemie využívá reakce amoniaku (vzniklého po reakci vzorku s ureázou) barevným indikátorem pH. Reakce probíhá na filmu nebo proužku a detekce je pomocí reflexní fotometrie. Na rozptylové vrstvě je imobilizovaná ureáza a v alkalickém prostředí prochází amoniak přes polopropustnou membránu a reaguje
s barevným indikátorem pH. Barvivo obsahuje merocyanin (maximum absorbance při 520 nm, obvyklé měření při 670 nm), bromkrezolovou zeleň (sleduje se změna ze zelené na modrou při 600 nm, s absorpčním maximem při 620 nm) nebo n-[bis(dinitrofenol)metyl]4-t-butylpyridinium chloride (sleduje se změna z bezbarvé na modrou při 642 nm) nebo N-propyl-4-(2,6-dinitro-4- chlorbenzyl)-chinoloniumetansulfát (sleduje se změna při 670 nm). Tyto metody mají vynikající přesnost a jen nepatrné interference. Problémem je omezení jejich používání pouze na analyzátory k tomu zvlášť určené. Rozsah měření v séru 0,71 – 42,83 mmol/l, v moči
23,91 – 899,39 mmol/l. Preciznost v sérii dosáhla CV v séru 1,5 – 3,0 %, v moči 1,8 – 3,4 %. Hemoglobin 0,5 g/l způsobí vychýlení mmol/l.

Automatizovaná kinetická luminometrie byla vyvinuta pro měření malého množství urey v biologických tekutinách a dialyzátu. Metoda je založena na hydrolýze urey a ATP ureázou (z kvasnic) v přítomnosti hydrogenuhličitanu. Tak vzniká amoniak, ADP a fosfát. Rychlost hydrolýzy je monitorována luminometricky reakcí ATP s luciferinem, katalyzované luciferázou a je přímo úměrná množství přítomné urey.

HPLC metody používají buď hydrofilní interakční chromatografie s gradientem mobilní fáze 90 % - 60 % acetonitrilu ve vodě a detekce při 210 nm, nebo derivatizace s xanthydrolem, kdy vzniká N-9H-xanthen-9-yl-urea, která se detekuje fluorescenčním detektorem (excitace 213 nm, emise 308 nm). Detekční limit je 50 nmol/l fluorochromu. Druhý uvedený postup byl navržen pro stanovení v moči.

Pro měření urey v hemodialyzátu se také používá blízká infračervená spektroskopie. Měření se provádí přímo během dialýzy v rozsahu 4720 – 460 cm-1. Vychýlení je od -4,21 do +6,48 %.

V současnosti není ustavena žádná referenční nebo definitivní metoda.
Navrhovaný referenční postup je izotopová diluce s GC-MS a [¹³C, ¹⁵N₂]ureou jako vnitřním standardem ekvilibrovaným s endogenní neznačenou ureou. Vzorky jsou pak deproteinovány etanolem. Značená
i neznačená urea je převedena na trimetylsilyl-deriváty 2 hydroxypyrimidinu. GC-MS postup sleduje ionty
m/z 153 a 168 pro neoznačenou ureu a m/z 156 a 171 pro izotopově značené analogy. Mez detekce metody je
0,006 mmol/l. Vzorky byly v rozsahu 1,8 – 61,2 mmol/l. Preciznost v sérii měla CV 0,67 – 0,77 %. Dosažená kombinovaná standardní nejistota výsledků byla 0,47 – 1,72 %.
Metoda je návazná na standardní referenční materiál SRM 912a (čistota 99,9% ± 0,1%), který je certifikován NIST (National Bureau of Standards, Washington).

Zpráva College of American Pathologists z roku 2001 uvádí, že nejvíce používanou metodou je enzymová metoda s ureázou a glutamátdehydrogenázou, kterou používalo více než polovina respondentů. Reakci
o-ftalaldehydem používalo 24 %, konduktometrii 18 % a < 1 % ionselektivní elektrodu pro amonné ionty. Dále zpráva uvádí preciznost stanovení koncentrace 7,14 mmol/l CV 3,0 – 3,4 pro konduktometrickou metodu, 3,1 – 5,1 % pro o-ftalaldehydovou metodu a 3,0 – 6,2 % pro glutamátdehydrogenázovou metodu. Dle kritérií kvality laboratoře (CLIA-88) má být dosahovaná přesnost ±0,71 mmol/l nebo ±9 %, podle toho, co je větší. Intraindividuální variace je v séru přibližně 12 % (10,3 – 17 %)a moči 17,8 – 22,7 %; interindividuální variace je
v séru 13,4 – 35 % a moči 20,0 – 28,1 %. Takže žádoucí preciznost odvozená z biologické variace má
CV < 6,2 %.

Toleranční limit EHK: 15 % (sérum, plazma), 17 % (moč); CV % pro vnitřní kontrolu kvality: 5 %.
Teoretický toleranční limit: 20,8 %.

Koncentraci urey v plazmě a séru snižují: acidóza, EDTA, fluorid, glukóza, hemodialýza, hemolýza, IGF 1, kouření, lipémie, oxalát, růstový hormon, těhotenství (zejména do 6. měsíce), tymol, vegetariánská dieta, zavodnění, aj.
Koncentraci urey v plazmě a séru zvyšují: aceton, alanin, alkalóza, amikacin, amikin, amoniak, arginin, cyklosporin, dehydratace, edecrin, elektrošok, etylenglykol, gentamycin, haemiton, interleukin-2, iso-mack, isoket, krezol, kyselina boritá, kyselina octová, metylurea, menopauza, netromycin, nutramin, proteinová dieta, stres, superanabolon, vínan, viskenit, xylitol, aj.

Koncentraci urey v moči snižují: bakteriální kontaminace, diurnální variace (pokles vylučování v noci), formaldehyd, IgG protilátky vůči ureáze, hladovění, kyselina boritá, kyselina octová, těhotenství (zejména do
6. měsíce), aj.
Koncentraci urey v moči zvyšují: alanin, glycin, nedostatek spánku, proteinová dieta, aj.