kortikotropin;

corticotrophin, corticotropin, corticotropin-lipotropin; adrenocorticotrophic hormone, adrenocorticotropic hormone, adrenocorticotrophin, adrenocorticotropin;

Stanovení v plazmě (antikoagulans EDTA) nejlépe směsný vzorek tří odběrů nalačno mezi 7. a 11. h (diurnální maximum). Vždy je třeba stanovit současně kortizol. Odběrová zkumavka musí být plastová nebo sklo potažené silikonem. Stabilita po bezprostřední separaci 1 – 2 h při 20 – 25 °C, 3 měsíce při -20 °C, dlouhodobě při -70 °C. Pro vyšší stabilitu se doporučuje přídavek aprotininu (Trasylol).

Starší postupy využívaly bioanalýzy a receptorové analýzy. Většina bioanalýz byla založena na účinku ACTH na buňky kůry nadledvinek a to stimulaci tvorby steroidů nebo spotřebovávání kyseliny askorbové. Analýzy se dělaly na zvířatech in vivo a byly drahé a složité. Receptorová analýza využívala rozpuštěné vazebné bílkoviny, získané z normálních nebo rakovinných buněk kůry nadledvinek. V neextrahované plasmě byl detekční limit 2,2 pmol/l.

V současnosti se používají pouze imunoanalýzy. Určitý problém je ale s nepříliš vysokou aviditou mnoha protilátek, protože potřebujeme detekovat hodnoty kolem 1 pmol/l. Proto se používají různé zahuš
eovací postupy jako extrakce nebo se prodlužuje inkubační čas imunoreakce. RIA oproti IRMA dává vyšší výsledky, protože zachytí i fragmenty a prekurzory ACTH.

RIA Uplatňuje se kompetitivní postup, kdy vzorky a kalibrátory jsou inkubovány 16 h (třepání) při 4 °C s ¹²⁵I-ACTH ve zkumavkách s protilátkou vůči ACTH. Po inkubaci se přidá precipitační činidlo (kozí proti-králičí IgG s polyetylénglykolem v TRIS pufru) a protřepe se za laboratorní teploty. Homogenát se centrifuguje v chlazené odstředivce 15 min. Pak se obsah zkumavek dekantuje a radioaktivita precipitátu se měří gama-počítačem (2 min). Signál je nepřímo úměrný koncentraci ACTH ve vzorku. Rozsah měření na základě osmibodové kalibrace 1,26 – 110 pmol/l. Koncentrace > 110 pmol/l se ředí nulovým standardem a znovu měří. Analytická citlivost je 1,26 pmol/l. Preciznost v sérii je 4,1 – 6,8 %, mezi sériemi 3,9 – 10,7 %; zpětný výtěžek 98 – 108 %. Křížová reakce: ≤ 0,8 %. Silná hemolýza a lipémie ruší.

IRMA ACTH je chemicky modifikováno na sukcinyl-ACTH (Acylační činidlo je sukcinylanhydrid v dimetylsulfoxidu). Samotný ACTH je nestabilní. V soupravě jsou použity tři myší monoklonální protilátky vůči třem různým epitopům molekuly sukcinyl-ACTH. Modifikované vzorky a kalibrátory se nejprve inkubují (1 h, třepání) ve zkumavkách potažených dvěma monoklonálními protilátkami vůči sukcinyl-ACTH. Po první inkubaci se obsah zkumavek pečlivě odsaje a pipetuje se do nich třetí protilátka, značená ¹²⁵I. Po druhé inkubaci (2 h, třepání) se obsah zkumavek odsaje a dvakrát promyje, aby se odstranila nenavázaná značená protilátka. Vázaná aktivita ¹²⁵I se poté měří na gama-počítači (1 min). Koncentrace ACTH ve vzorcích je přímo úměrná změřené radioaktivitě a získá se interpolací šestibodové kalibrační křivky. Celý postup se provádí za laboratorní teploty. Rozsah měření 0,26 – 330 pmol/l. Analytická citlivost 0,26 pmol/l. Preciznost v sérii je 6,9 – 9,1 %, mezi sériemi 6,2 – 9,6 %; zpětný výtěžek 100 – 110 %, linearita ředění 99 – 113 %. Při analýze mohou interferovat heterofilní protilátky.

ELISA v sendvičovém uspořádání probíhá v mikrotitrační destičce se zakotveným streptavidinem. Do jamky se přidá standard nebo vzorek, biotinylovaná (kozí polyklonální) protilátka vůči ACTH (34-39), protilátka (myší monoklonální) vůči ACTH (1-24) s navázanou křenovou peroxidázou a inkubuje se 4,5 h ve tmě (třepání).  Po inkubaci následuje pětinásobné promytí a přidá se chromogen tetrametylbenzidin a reakce probíhající 30 min je zastavena stop činidlem (1 M H₂SO₄). Měření se provádí do 10 min při 450 nm (do 33 pmol/l) a pro vyšší koncentrace (do 110 pmol) následně při 405 nm. Celý postup se realizuje za laboratorní teploty. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 4400 pmol/l. Rozsah měření na základě šestibodové kalibrace je 0,22 – 110 pmol/l. Detekční limit je 0,22 pmol/l. Preciznost v sérii je 3,1 – 4,2 %, mezi sériemi 5,8 – 6,2 %. Linearita ředění 89 – 103 %, zpětný výtěžek 87,7 – 106,4 %.

CLIA je dvojstupňový zábleskový postup, kdy na magnetické částice potažené myší monoklonální protilátkou se naváže během první inkubace (10 min) ACTH a po promytí se na jeho další epitop připojí během další inkubace (10 min) druhá monoklonální protilátka značená izoluminolem. Po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je přímo úměrná hladině ACTH. Rozsah měření je na základě dvoubodové kalibrace 0,35 – 330 pmol/l (při vyšších hodnotách lze sérum ředit diluentem dle potřeby). Analytická citlivost je 0,35 pmol/l. Preciznost v sérii 2,7 – 4,9 %, mezi sériemi 2,6 – 8,9 %. Linearita ředění je 104 – 114 %, zpětný výtěžek 93 – 109 %. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 34131 pmol/l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu (5g/l), bilirubinu (141 µmol/l) a triacylglycerolů (33,9 mmol/l) neruší. Křížová reaktivita ≤ 0,2 %.

Jiné stanovení je založeno na sekvenční imunochemické reakci, kde je ALP jako marker. ACTH se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váže jedním epitopem na monoklonální myší protilátku imobilizovanou na polystyrenové kuličce. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí reaguje druhý epitop ACTH s polyklonální králičí protilátkou konjugovanou s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se ihned rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření je přímo úměrná koncentraci ACTH ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Linearita metody je do 278 pmol/l. Analytická citlivost: 1,1 pmol/l. Preciznost v sérii 6,7 – 9,5 %, mezi sériemi 6,1 – 10,0 %. Zpětný výtěžek:  89 – 111 %, linearita ředění 89 – 114 %. Efekt nadbytku antigenu se do 333000 pmol/l neprojevuje. Hemoglobin do koncentrace 5,12  g/l, bilirubin do koncentrace 342 µmol/l a triacylglyceroly do 56,5 mmol/l neruší stanovení. Při analýze mohou interferovat heterofilní protilátky. Křížová reaktivita: ACTH (18-39) až 17,3 %, ostatní ≤ 0,5 %.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (10 µl) je inkubován s biotinylovanou monoklonální myší protilátkou vůči ACTH a monoklonální myší protilátkou vůči ACTH značenou ruthéniovým komplexem za vzniku sendvičové formace. Pak se přidají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem a celý komplex je vázán na pevnou fázi pomocí biotin-streptavidinové kotvy. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Luminiscence je přímo úměrná koncentraci ACTH ve vzorku. Triacylglyceroly (17 mmol/l), hemoglobin (4 g/l), bilirubin (428 µmol/l) a RF (< 400 kIU/l) neruší. Od pacientů léčených vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměly odebírat vzorky dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Metoda je použitelná v rozsahu 0,22 – 440 pmol/l. Detekční limit je 0,22 pmol/l. Preciznost v sérii CV 0,7 – 3,6 %, mezi sériemi 2,2 – 5,4 %. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 220200 pmol/l. Křížová reaktivita: ACTH (22-39) až -2,94 %, ACTH (18-39) až -1,42 %, ostatní ≤ -0,76 %. Ve vzácných případech je možné pozorovat interferenci způsobenou velmi vysokým titrem protilátek proti streptavidinu nebo rutheniu. Při analýze mohou interferovat heterofilní protilátky.

WHO standard 74/555 National Institute of Biological Standards and Control (UK).

Hodnoty snižuje: ztráta hmotnosti u obézních, premenstruační syndrom, věk > 70 (ženy), interleukin-6, oxytocin, laktace, odběr do skleněných zkumavek, heparin, pozdní zpracování, někdy dexametazon.

Hodnoty zvyšuje: kokain, kouření (až +100 % u pacientů s hypertenzí, ostatní +20 %), stres (ústní zkouška +59 %), psychická a tělesná zátěž (maraton 3,7x, bicyklový ergometr 5,5x), expozice CO, kritické stavy, sauna (3x), poslední trimestr těhotenství, spánek, věk > 70 (muži), horečka; léky: erytropoetin, estrogeny, etanol, glukagon, inzulin, kortikosteroidy, metopiron, spironolakton.