dRVVT, Diluted Russell s Viper Venom Test, DVVtest, DVVconfirm, lupus antikoagulans (LA)

Vyšetření se provádí z citrátové plazmy chudé na destičky, která se získá odběrem žilní krve do zkumavky s citrátem sodným v poměru 1 díl citrátu + 9 dílů krve. Koncentrace citrátu se doporučuje v rozmezí 0,105 až 0,109 mol/l. Při venepunkci je doporučeno používat jehlu o průměru 0,7 až 1,0 mm (tenčí jehly mohou způsobit hemolýzu a předčasnou aktivaci destiček a koagulačních faktorů) a je nutné vyvarovat se použití škrtidla >1 min. Doprava materiálu do laboratoře do 2 h. Vzorek se centrifuguje 15 min při 3000 g, volíme opakovanou centrifugaci a oddělujeme plazmu 0,5 – 1,0 cm nad suspenzí erytrocytů, jelikož trombocyty obsahuji fosfolipidy a v jejich přítomnosti by mohl být test zkreslený. Počet trombocytů v plazmě má být < 10⁴/µl. Alternativou je filtrace plazmy přes mikronový filtr 0,22 µm. Vzorek plazmy lze skladovat 4 h při 0 – 8 °C nebo 3 měsíce při -70°C . Pro následné zpracování zmrazené plazmy je nutno plazmu rozmrazovat po dobu 5 min ve vodní lázni při 37 °C, šetrně promíchat a ihned provést měření, nebo skladovat < 2 h při 2 – 8°C. Rozmražené vzorky plazmy nelze opakovaně zamrazovat.Při zpracování vzorku je nutné se vyvarovat lýze trombocytů.

Jedná se o screeningový test v rámci laboratorní diagnostiky protilátek typu lupus antikoagulans. Test využívá enzym izolovaný z hadího jedu Rusellovy zmije (Daboia ruselli). K vyšetřovanému vzorku se při 37°C přidá reagencie obsahující jed Russelovy zmije, Ca²⁺ a malého množství fosfolipidů. Táto směs je schopná aktivovat faktor X na faktor Xa, který pak aktivuje protrombin na trombin a ten štěpí fibrinogen za vzniku fibrinové sraženiny a sleduje se čas koagulace. V přítomnosti protilátek vůči fosfolipidům, dojde k jejich neutralizaci a koagulační čas se prodlužuje. Výsledek se udává jako poměr času vyšetřovaného vzorku a normální plazmy. Jako normální plazmu je lépe použít komerční plazmu, která je deklarovaná na nepřítomnost lupus antikoagulans.

V případě pozitivního výsledku je možné použít konfirmační test s přídavkem fosfolipidů. V přítomnosti antifosfolipidových protilátek dojde k jejich neutralizaci a koagulační čas se normalizuje. V případě prodloužení testu i v nadbytku fosfolipidů se spíše jedná o deficit faktorů, i proto by měly být ve vyšetřované plazmě nejdříve vyšetřeny hladiny faktorů II, V, X a fibrinogen a vyloučeny jiné inhibitory. V případě nedostatku některých faktorů a současného podezření na přítomnost LA, je možné vyšetřit test ze vzorku smíchaného s normální plazmou v poměru 1:1 (normalizace hladin faktorů). Nevýhodou této úpravy je, že se nemusí zachytit nízké titry antifosfolipidových protilátek (nižší titr neznamená menší klinické projevy).

Nejčastější typ detekce je optický (turbidimetrie) a mechanický (kovová kulička v magnetickém poli). Obě metody mají své výhody i nevýhody. Optické metody jsou finančně méně náročné, jelikož stačí převážně 150 µl reakční směsi v kyvetě, kdežto u mechanické detekce je nutný objem větší, aby se kulička celá ponořila. Mechanická detekce na druhé straně není závislá na zbarvení, resp. zakalení vzorku (ikterické, chylózní, hemolytické vzorky), což lze u optické metody minimalizovat detekcí při 671 nm. U optických analyzátorů je nutné zohlednit i způsob odečtu času koagulace z reakční křivky. Většina přístrojů volí inflexní bod křivky, nebo 50 % absorbance, kde počáteční absorbance se bere jako 0 % a konečná 100 %. Nejvhodnější je způsob odečtu matematickým zpracováním křivky, a to její druhou derivací, kde se koagulační čas odečte v maximu druhé derivace původní reakční křivky. Je to část křivky, kde dochází k největšímu nárůstu koagula.

Preciznost v serii je 2 - 5 %, mezi sériemi <5,5 % 

u pacientů s hematokritem < 0,2 a > 0,6 musí být upravený poměr antikoagulační přísady.

Zkrácení testu: špatné zpracování vzorku (nedostatečná centrifugace, přítomnost trombocytů, lýza trombocytů)

Prodloužení testu: špatný odběr (sražený vzorek), nedostatek faktoru II, V, X, fibrinogenu nebo přítomnost inhibitoru proti těmto faktorům; heparin > 1,0 U/ml, vysoký titr protilátek proti FVIII, přímé inhibitory trombinu, antagonisté vitaminu K (warfarin).