Pod tímto názvem se podle IUPAC rozumí vitamin především vitamin D₃, tj. kalciol neboli cholekalciferol.

Do třídy vitaminů D uvádí IUPAC (jako semisystematické) ještě tyto názvy: kalcidiol (25-hydroxycholekalciferol), kalcitriol (1α,25-dihydroxycholekalciferol), erkalciol neboli ergokalciferol, erkalcitriol (1α,25-dihydroxyergokalciferol), (24S)-metylkalciol neboli 22,23-dihydroerkalciol (22,23-dihydroergokalciferol), kalcitetrol (1α,24R,25-trihydroxycholekalciferol), (6Z)-takalciol (provitamin D₃), takalciol (tachysterol₃), (5E)-isokalciol (izovitamin D₃), dihydroerkalciol (dihydrotachysterol₃).

Další synonyma: 1,25-DHCC, 1,25-dihydroxy-22-ovavitamin D(3), 1,25-dihydroxycholecalciferol, 1,25-dihydroxy-vitamin-D, 1,25-dihydroxyvitamin D3, 1,25-diOHC, 1,25(OH) 2D3, 1-alpha (OH) D3, 19-nor-1, 1-alpha-hydroxycholecalciferol, 1-alpha-hydroxyvitamin D2, 1-hydroxyvitamin D, 22-oxacalcitriol (OCT), 24,25(2OH)vitamin D(3), 25 hydroxyvitamin D (25(OH)D), 25-dihydroxyvitamin D2, 25-dihydroxyvitamin D2, 19-nor-1, 25-HCC, 25-hydroxycholecalciferol, 25-hydroxyvitamin D, 25-hydroxyvitamin D3, 25-OHCC, 25-OHD3, activated 7-dehydrocholesterol, activated ergosterol, alfacalcidol, calcifediol, calcipotriene, calcipotriol, calcitriol, cholecalciferol, colecalciferol, dichysterol, dihydrotachysterol, dihydrotachysterol 2, doxercalciferol, ecocalcidiol, ED-21 (vitamin D analog), ED-71 (vitamin D analog), ergocalciferol, ergocalciferolum, falecalcitrol, hexafluoro-1,25dihydroxyvitamin D3, irradiated ergosterol, maxacalcitol, MC903, paracalcin, paricalcitol, tacalcitol, viosterol.

Stanovuje se v plazmě (antikoagulans heparin, resp. EDTA) nebo séru. Odběr ráno nalačno. Krev chránit před světlem a dopravovat na ledu. Stabilita D₃ při 4 – 8 °C 3 d, při -20 °C 1 rok. Vzorek lze opakovaně rozmrazit.

Stanovení 25-hydroxyvitaminu D

Kompetitivní vazebná analýza se specifickým vazebným proteinem: vzorek a ³H-25-hydroxyvitamin D soutěží o vazebná místa na vitamin D-vazebném proteinu. Při stanovení ruší mastné kyseliny, které nelze zcela oddělit. Subnormální hladiny se stanovují obtížně a vyžaduje se beta-počítač.

RIA měří sumární koncentraci vitaminu D₂ a D₃. Po imunoprecipitaci a extrakci se extrakt pipetuje do polystyrenových zkumavek potažených protilátkou vůči stanovovaným analytům. O vazebná místa soutěží analyty ze vzorku a analyty značené ¹²⁵I. Po inkubaci (110 min, laboratorní teplota) se roztok odsaje, promyje a měří se signál gama-počítačem. Sedmibodová kalibrace umožňuje měření v intervalu 3,25 – 420 nmol/l, citlivost metody je 3,25 µg/l. Preciznost v sérii je < 7 %, mezi sériemi < 9 %. Výsledky jsou k dispozici za 3 h od začátku analýzy.

ELISA na mikrotitračních destičkách v kompetitivním uspořádání má rozsah 14,75 – 300 nmol/l a celkovou dobu provedení < 2,5 h. Celková preciznost je < 10 %.

Jiná metoda je podrobněji popsaná. Kompetice o monoklonální protilátku vůči 25-hydroxyvitaminu D, zakotvenou v jamkách mikrotitračních destiček, probíhá mezi analytem ze vzorku a analytem značeným biotinem. Po inkubaci (2 h) se nenavázaný materiál odstraní trojnásobným promytím. Přidá se streptavidin značený POD a po další inkubaci (30 min) a trojnásobném promytí chromogen tetrametylbenzidin s peroxidem vodíku a reakce probíhající ve tmě 15 min (třepání) je zastavena stop činidlem (0,5 M H₂SO₄). Měření bichromaticky při 450 nm nutno provést do 30 min (proti 620 – 650 nm). Celý postup se realizuje za laboratorní teploty. Rozsah měření na základě šestibodové kalibrace je 4 – 300 nmol/l (při vyšších koncentracích se provádí ředění 2x). Preciznost v sérii je 3,2 – 4,9 %, mezi sériemi 7,0 – 8,6 %. Linearita ředění 99 – 115 %. Stanovení neruší hemoglobin do 10 g/l, triacylglyceroly do 22,6 mmol/l a bilirubin do 342 µmol/l.

Lze také získat soupravu stanovující pouze 25-hydroxyvitamin D₃ (pomocí monoklonální protilátky), která má rozsah 0(?) – 500 nmol/l, celkovou dobu provedení 1 h a celkovou preciznost < 10 %. Toto stanovení lze provést i z celé krve.

Homogenní enzymová imunoanalýza s vazbou na vitamin D vazebný protein. Rozsah metody je 12,5 – 312,5 nmol/l. Provedení je kratší než 2 h. Preciznost v sérii i mezi sériemi je < 10 %.

Chemiluminiscenční imunoanalýza v kompetitivním uspořádání probíhá v jednom reakčním stupni. Po pipetování vzorku se přidá analog vitaminu D konjugovaný s fluoresceinem v pufru a roztok se inkubuje při 37 °C 4,5 min, dále se přidá monoklonální myší protilátka vůči vitaminu D značená esterem akridinu. Roztok se inkubuje při 37 °C 5,5 min, přidají se paramagnetické latexové částice potažené myší monoklonální protilátkou proti fluoresceinu spolu s analogem vitaminu D konjugovaným s fluoresceinem. Opět se inkubuje při 37 °C 2,75 min. Po odsátí roztoku a promytí zkumavek se přidá peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk fotonásobičem při 429 nm, který je nepřímo úměrný koncentraci 25-hydroxyvitaminu D. Rozsah metody je 9,25 – 375 nmol/l. Vzorky s koncentrací vitaminu D > 375 nmol/l se ředí manuálně 2x. Stanovení vykazuje vysokou specificitu pro 25-hydroxyvitamin D₂ a 25-hydroxyvitamin D₃. Limit blanku byl 4 nmol/l, mez detekce 8 nmol/l, mez kvantitativního stanovení 8,8 nmol/l, funkční citlivost 8,3 nmol/l. Preciznost v sérii 2,7 – 7,0 %, celková 4,8 – 11,1 %. Zpětný výtěžek byl 83,3 – 100,2 %. Neruší hemolýza do 15,5 g/l hemoglobinu, triacylglyceroly do 4,07 mmol/l a bilirubin do 684 µmol/l.

CLIA je kompetitivní chemiluminiscenční analýza ke stanovení 25-hydroxyvitaminu D v séru. Při inkubaci (10 min) se analyt ve fosfátovém pufru uvolní z vazebného proteinu a váže se na specifickou protilátku zakotvenou na magnetických částicích. Pak se přidá vitamin D značený izoluminolem. Po další inkubaci (10 min) se nevázaný materiál odstraní promytím. Pak se přidá startovací činidlo (4 % NaOH + 0,12 % H₂O₂) a fotonásobičem se sleduje luminiscence, která je nepřímo úměrná koncentraci analytu. Rozsah metody je 10 – 375 nmol/l, vyšší koncentrace se ředí manuálně 5x. Interference dihydroxyvitaminů jsou vysoké (D₃ 17 %, D₂ 40 %). Hemolýza, chylozita a ikterus neruší. Preciznost v sérii byla 5,2 – 8,1 %, mezi sériemi 6,9 – 12,7 %. Zpětný výtěžek byl 97 – 111 %.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v kompetitivním uspořádání trvá 27 min. Inkubací vzorku (15 µl) s přípravnou reagencií (roztok dithiothreitolu a hydroxidu sodného) je vázaný vitamin D (25-OH) uvolněn z vitaminu D vážícího proteinu. Inkubací předpřipraveného vzorku ruthéniem značeného vitamin D vážícího proteinu vznikne komplex mezi vitaminem D (25-OH) a vitamin D vážícím proteinem značeným rutheniem. Po přidání streptavidinem potažených paramagnetických mikročástic a vitaminu D (25-OH), značeného biotinem, dojde při další inkubaci k obsazení volných ruthéniem značených vitamin D vážících proteinů. Vznikne komplex skládající se z rutheniem značeného vitamin D vážícího proteinu a biotinylovaného vitaminu D (25-OH), který se naváže na pevnou fázi interakcí biotinu a streptavidinu. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Luminiscence je nepřímo úměrná koncentraci 25-hydroxyvitaminu D ve vzorku. Při hemolýze (> 2 g/l hemoglobinu) jsou výsledky falešně vyšší. Chylozita a ikterus neruší. Od pacientů léčených vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměly odebírat vzorky dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Metoda je použitelná v rozsahu 7,5 – 175 nmol/l. Limit blanku byl 5 nmol/l, mez detekce 7,5 nmol/l, mez kvantitativního stanovení 12,5 nmol/l (CV celková ≤ 30 %), funkční citlivost 10 nmol/l (CV mezi sériemi ≤ 20 %). Preciznost v sérii CV 2,7 – 7,8 %, mezi sériemi 3,7 – 10,7 %. Protilátky vůči streptavidinu a rutheniu mohou interferovat.

HPLC měří současně koncentraci vitaminu D₂ a D₃. Provádí se extrakce do éteru nebo acetonitrilu a izokratické dělení na koloně (SiO₂ 125 mm) na normální fázi (n-hexan) při 30 °C a fotometrická detekce při 254 nebo 265 nm. Detekční limit metody je 2,48 µg/l. Preciznost pro 25-hydroxyvitamin D₃/D₂ v sérii 4,58/9,07 % mezi sériemi 5,08/8,39 %, zpětný výtěžek 94,8/96,6 %, linearita ředění umožňuje stanovení až do 500 µg/l.

LC-MS/MS probíhá na reverzní fázi C₁₈ v gradientovém uspořádání s MS elektrosprejí. Citlivost je extrémně vysoká (rozsah měření 0,05 – 2,5 nmol/l).

K dispozici jsou standardy NIST pro 25-hydroxyvitamin D₂ a D₃ z roku 2010 a to SRM 972 (4 materiály v normálním rozmezí) a SRM 2972 (2 materiály s vysokou koncentrací).

Toleranční limit EHK: 33 %.

Stanovení 1,25-dihydroxyvitaminu D

Radioreceptorová analýza používá telecí tymus, který se jeví nejvýhodnější a váže jak D_2, tak D₃. Detekční limit metody je 4,8 – 12 pmol/l.

RIA měří sumární koncentraci vitaminu D₂ a D₃. Může se také používat kompetice se značkou ³H nebo ¹²⁵I. Polystyrenové zkumavky jsou potažené protilátkou vůči stanovovaným analytům. O vazebná místa soutěží analyty ze vzorku a analyty značené ¹²⁵I. Po inkubaci přes noc se roztok odsaje, promyje a měří se signál gama-počítačem. Rozsah měření je 11,3 – 986 pmol/l, citlivost metody je 3,84 pmol/l.

Hodnoty snížené: fenobarbital, fenytoin, glukokortikoidy, cholesterylamin, izoniazid, izotretinoin, karbamazepin, ketokonazol, kolestipol, primidon, rifampicin. Dále: celiakie, cholestatická játra, deficit slunečního světla, osteomalacie, pseudohypoparatyreóza, rachitida, nefrotický syndrom a jiné.

Hodnoty zvýšené: estrogeny, oktreotid, prednison. Dále: hyperparatyreóza, laktace, nadměrný příjem vitaminu D, sarkoidóza, těhotenství, po cvičení a jiné.