total anti-insulin antibodies, total AIA, total insulin antibody, total anti-insulin antibody, total INS antibody

Odebírá se venosní srážlivá krev nalačno nebo před aplikací inzulinu. Sérum je stabilní při 4 – 8 °C 1 – 7 d, při -20 °C 1 rok. Stanovení lze provést i v plazmě (antikoagulans EDTA nebo heparin).

RIA začíná úpravou vzorku extrakcí v kyselém prostředí glycinového pufru s aktivním uhlím (dochází k uvolnění protilátek vázaných na inzulin a navázání inzulinu na uhlí). Po protřepání a inkubaci 10 min se přidá neutralizační barbitalový pufr. Zkumavka se protřepe a centrifuguje. Odpipetuje se část supernatantu, ke kterému se přidá ¹²⁵I-inzulin a inkubuje 2 h za laboratorní teploty. Pak se přidá precipitační činidlo (polyetylenglykol), protřepe se a inkubuje 10 min za laboratorní teploty. Po centrifugaci se odsaje supernatant a precipitátu se měří radioaktivita gama-počítačem (1 min). Výsledky se udávají jako % celkové radioaktivity. Preciznost v sérii je 1,0 – 17,1 %, mezi sériemi 3,1 – 12,1 %. Nepoužívejte silně hemolytické (> 10 g/l), ikterické (> 427 µmol/l) ani lipemické (> 22,6 mmol/l) vzorky.

ELISA autoprotilátky používá dvou protilátek: polyklonální vůči inzulinovým autoprotilátkám je značená křenovou peroxidázou a druhá myší monoklonální vůči inzulinovým autoprotilátkám je zakotvená v jamkách mikrotitrační destičky. Do mikrotitrační destičky se pipetuje vzorek, konjugát protilátky s peroxidázou a inkubuje se 60 min při 37 °C. Po promytí (5x) se přidá substrát tetrametylbenzidin s H₂O₂ a inkubuje se 10 – 15 min při 20 – 25 °C ve tmě. Pak se přidá stop činidlo (ředěná H₂SO₄) a měří se ihned při 450 nm, kdy absorbance je přímo úměrná koncentraci autoprotilátek protilátek vůči inzulinu. Šestibodová kalibrace umožňuje měření v intervalu 1 – 1000 ng/l. Mez detekce je 1 ng/l. Preciznost v sérii je 4,4 – 5,6 %, mezi sériemi 6,6 – 7,9 %; zpětný výtěžek 94 – 103 %, linearita ředění 92 – 107 %. Silná hemolýza a lipémie ruší analýzu.

ELISA IgG sendvičového typu používá mikrotitrační destičky potažené inzulinem. Do jamek se pipetuje standard, ředěný vzorek nebo kontrola a inkubuje 30 min. Po inkubaci a promytí 3x se přidá konjugát lidského IgG s křenovou peroxidázou a inkubuje 15 min; následuje promytí 3x a přidání chromogenu (tetrametylbenzidin) a další inkubace 20 min, kdy se vyvíjí modré zbarvení. Pak se přidá stop činidlo. Barevná reakce je ukončena přidáním kyselého stop činidla a měřením absorbance žlutého zbarvení při 450/600-650 nm do 30 min, která je přímo úměrná množství IgG protilátek vůči inzulinu. Celý postup se provádí za laboratorní teploty. Výsledky se udávají v kU/l. Šestibodová kalibrace umožňuje měření v intervalu 6,3 – 100 kU/l. Mez detekce je 0,5 kU/l. Preciznost v sérii je 2,5 – 4,0 %, mezi sériemi 4 – 6 %; zpětný výtěžek 94 – 103 %, linearita ředění 92 – 107 %. Silná hemolýza a vysoký bilirubin neruší analýzu.

ELISA IgG kvalitativně sendvičového typu používá mikrotitrační destičky potažené inzulinem. Do jamek se pipetuje standard, ředěný vzorek nebo kontrola a inkubuje 12 – 16 h při 2 – 8 °C. Po inkubaci a promytí 3x se přidá konjugát kozí protilátky specifické vůči lidskému IgG s ALP a inkubuje 1 h při 25 °C; následuje promytí 3x a přidání chromogenu (4-nitrofenylfosfát) a další inkubace 30 min při 25 °C, kdy se vyvíjí zbarvení ve tmě. Pak se přidá stop činidlo (1 M NaOH). Barevná reakce je ukončena přidáním stop činidla a měřením absorbance při 405 nm, která je přímo úměrná množství IgG protilátek vůči inzulinu. Výsledky se hodnotí pouze kvalitativně ve srovnání s cut-off kalibrátorem. Výsledky < 0,95 cut-off jsou negativní, > 1,05 cut-off jsou pozitivní.

Western blot Nitrocelulózová membrána se inkubuje s ředěným sérem, 5 % hovězím albuminem v pufru TRIS, obsahujícím 0,1 % Tween při 4 °C za pomalého třepání přes noc. Pak se promyje 3x vždy 5 min pufrem stejného složení. Dále se inkubuje za laboratorní teploty a jemného třepání 1 h s protilátkou vůči myšímu IgG, protilátkou vůči biotinu a protilátkou značenou křenovou peroxidázou v blokovacím pufru, který obsahuje navíc odstředěné mléko. Pak se promyje 3x vždy 5 min pufrem s ředěným sérem, 5 % hovězím albuminem v pufru TRIS, obsahujícím 0,1 % Tween. Přidá se luminogen (derivát luminolu + sůl peroxykyseliny), inkubuje se 1 min, odstraní se přebytek roztoku (membrána zůstane vlhká), zabalí se do plastové folie a nechá se exponovat na rtg film.

V dostupné literatuře nejsou uvedené.