High-density lipoprotein cholesterol, α₁-lipoprotein (nepřesné označení)

HDL, HDL-C

Odběr nalačno, vhodná doba lačnění je 12 hodin; večer před plánovaným odběrem krve pacient nejí maso, nepije mléko, neukouří a nepožívá alkohol. Optimální je stabilní dieta po tři týdny. Doporučuje se preferovat stanovení v plazmě před stanovením v séru. Krev se odebírá vsedě (rozdíl mezi hodnotami vsedě a vleže je
6 až 15 %), delší použití manžety je nevhodné. Tři minutová komprese vény může zvýšit koncentraci cholesterolu v krvi o 10 %. Krevní elementy je třeba oddělit do 2 – 3 h od náběru.
Sérum – stabilita vzorku: 20 – 25 °C: 1 – 2 dny, 2 – 8 °C: 2 – 7 dní, -20 °C: 12 týdnů. Plazma – stabilita vzorku: 20 – 25 °C: 1/2 – 2 dny, 2 – 8 °C: 2 – 9 dní, -20 °C: 12 týdnů. Lze použít EDTA. Při teplotě < -50 °C je vzorek stabilní alespoň 2 roky. Mrazení a rozmrazení vzorku je možné jen jednou a po rozmrazení je třeba vzorek jemně promíchat.

Výsledek ovlivňuje fyzická zátěž, alkohol a léky. Stanovení má významný intraindividuální rozptyl, proto je nutné ho před diagnostickými závěry opakovat. Stanovení neruší triacylglyceroly < 10,2 mmol/l, hemoglobin < 2 g/l
a bilirubin < 171 µmol/l.

HDL lze rozdělit ultracentrifugací s gradientem hustoty nebo elektroforézou na polyakrylamidovém gelu
s gradientem hustoty na dvě základní skupiny: HDL₂ a HDL₃. Heterogenita HDL se projevuje také při chromatografiích nebo izoelektrické fokusaci. HDL sestává z 50% proteinů (Apo AI a Apo AII), 25% fosfolipidů, 20% cholesterolu a 5% triacylglycerolů.

Přímé postupy stanovení pomocí analytické ultracentrifugace (referenční metoda) nebo izolací HDL (chromatografie na koloně, elektroforéza, preparativní ultracentrifugace nebo polyaniontová precipitační technika) s následným gravimetrickým stanovením jsou časově a i finančně náročné.

Obvyklý postup je izolovat HDL frakci a změřit v ní cholesterol. V současné době se používají následující izolační metody:

Preparativní ultracentrifugace: 105 000 g po dobu 24 h při 16° C. Odstraní se supernatant (VLDL a LDL)
a ve zbytku se analyzuje HDL.

Iontově-výměnná chromatografie a gelová permeační chromatografie: separují HDL na základě náboje nebo molekulové hmotnosti. Používá se např. hydroxyapatit jako náplň . Tyto metody vyžadují standardizované kolony, dále zahuštění eluátu k analýze cholesterolu a poměrně velké množství vzorku. Proto se používají jen velmi omezeně.

Preparativní elektroforéza ve škrobovém bloku nebo bloku dle Geon-Pevikona dělí lipoproteiny podle náboje
a jejich velikosti. HDL molekuly jsou menší a mají proto vyšší pohyblivost směrem k anodě.
Elektroforéza na agarozovém gelu používá k detekci cholesterolové enzymové činidlo (cholesterolesteráza
a oxidáza a peroxidázový indikátor). Cholesterolesteráza byla v poslední době nahrazena cholesteroldehydrogenázou a jako chromogen se pak používá nitrotetrazoliová modř (nerozpustná a odolná vůči redukci). Vyhodnocení se provádí densitometrem. Tento postup se v rutinní praxi nepoužívá, protože je založen na rozlišení β- preβ- a α-lipoproteinů při kterém interferují β-VLDL a Lp(a). HDL je podhodnocen
o 10 %, jestliže se k vizualizaci lipoproteinových pásů použije fosfowolframan sodný s MgCl₂.
Elektroforéza na polyakrylamidovém diskovém gelu koreluje poměrně dobře s ultracentrifugací.

Precipitace roztoky polyaniontů je jednoduchá, rychlá a levná. Při tomto postupu jsou vysráženy všechny lipoproteiny kromě HDL. Nejvíce se používají následující činidla: heparin-MnCl₂, heparin-CaCl₂, dextran sulfát-MgCl₂, fosfowolframan sodný-MgCl₂ a polyetylenglykol.
Lze také použít dextran sulfát s doporučenou molekulovou hmotností 50000, pak výsledky odpovídají metodě heparin-MgCl₂. Kombinace dextran sulfát-MgCl₂ poskytuje výsledky kompatibilní s enzymovou metodou. Fosfowolframan sodný a zejména polyetylenglykol dávají nižší výsledky pro HDL než enzymová metoda. Použije-li se fosfowolframová kyselina-MgCl₂ jsou výsledky jen nepatrně nižší, pokud jsou triacylglyceroly
< 4,0 mmol/l, ale činidlo je málo stabilní.
Magnetická precipitace: LDL a VLDL se vysráží dextran sulfátem m. h. 50000 s navázaným železem a separace se provede magnetem, takže není třeba centrifugace.

Homogenní postupy jsou vhodné pro automatické analyzátory a dnes se nejvíce používají. Tyto postupy nevyžadují předběžnou úpravu vzorku před analýzou a separaci frakcí. Používají se protilátky proti apolipoproteinu B a/nebo apolipoproteinu CIII, případně s různými komplexujícími činidly (cyklodextrin
s hořečnatými solemi), které tvoří rozpustné komplexy s chylomikrony, LDL a VLDL. Tyto metody nejsou ale spolehlivé při neobvyklém složení lipoproteinů ve vzorku.
První postup vyžadoval čtyři činidla: polyetylenglykol vyvolal agregaci apoliproteinu B-100, který obsahuje chylomikrony, VLDL a LDL; následně byly agregované lipoproteiny zablokovány protilátkami vůči apolipoproteinům B-100 a C. Ve třetím stupni byla provedena reakce nechráněných HDL
s cholesterolesterázou, cholesteroloxidázou a peroxidázou, která byla nakonec zastavena guanidinovými solemi, aby se mohla provést barevná detekce. Tento postup je nevhodný pro většinu analyzátorů, protože neumožňují přidávat 4 činidla.
Druhý postup používal sulfonované α-dextriny s hořečnatými solemi, blokujícími chilomikrony a VLDL. Poté se přidal polyetylenglykol 6000, který vázal kovalentně HDL a zvyšoval jejich specifitu vůči cholesterolesteráze
a cholesteroloxidáze.
Třetí možností je použití syntetického polymeru spolu s polyaniontem k blokování jiných než HDL částic. Pak se přidává detergent, který odhaluje pouze HDL pro reakci s enzymy a substráty.
Čtvrtá metoda je založena na imunoinhibici. První činidlo obsahuje protilátku vůči lidskému apo B-100, která reaguje s lipoproteiny obsahujícími apo B-100: chylomikrony, VLDL a LDL. Druhé činidlo pak obsahuje enzymy.
Pátá homogenní metoda nechává v prvním kroku reagovat esterázu a oxidázu se všemi lipoproteiny kromě HDL. Tak vzniká peroxidáza, který je likvidována katalázou. Druhé činidlo obsahuje inhibitor katalázy
a detergent, které reagují s HDL za vzniku zbarvení při katalýze peroxidázou.

Vzhledem k tomu, že přímé metody stanovení HDL lipoproteinů jsou náročné, je jako referenční metoda navrhována precipitace heparin-MnCl₂ s následným stanovením cholesterolu Liebermann-Burchardovou metodou (enzymová stanovení nadhodnocují výsledek pro cholesterol).
V roce 1998 byla jako referenční navržena také homogenní dvojčinidlová metoda se složením reaktantů: reagens 1: 0,5 mmol/l α-cyclodextrin sulfát, 0,5 g/l dextran sulfát, 2 mmol/l MgCl₂ a 0,3 g/l N-etyl-
N-(3-metylfenyl)-N´-sukcinyletylendiamin v pufru 30 mmol/l; reagens 2: cholesterolesteráza ≥ 16,7 µkat/l vázaná na PEG, cholesteroloxidáza ≥ 93,3 µkat/l vázaná na PEG, peroxidáza ≥ 500 µkat/l a 4-aminofenazon
(0,5 g/l) v pufru 30 mmol/L 3-(N-morfolino)propansulfonové kyseliny (pH 7,0). Vzorek (4 µl) byl smíchán s 300 µl činidla 1 a směs inkubována 5 min při 37 °C. Poté bylo přidáno činidlo 2 (100 µl) a opět proběhla inkubace
5 min. Výsledné zbarvení bylo měřeno bichromaticky (600/700 nm). Dosažená preciznost v sérii byla CV 0,60 – 1,23 % a celková přesnost CV 0,84 – 3,08 %; vychýlení +4,5 % a celková chyba 10,5 %.

Reference Material Institute for Clinical Chemistry Standards Sadako Japonsko používá certifikovaný materiál pro měření celkového cholesterolu v lidském séru pod označením JCCRM 211-M, kde je uvedena také hodnota pro HDL cholesterol po precipitaci s dextran sulfátem-Mg²⁺ a stanovením cholesterolu Abell-Kendallovou metodou anebo po precipitaci dextran sulfátem-Mg²⁺ a stanovení cholesterolu dehydrogenázovou metodou při 340 nm.

Koncentraci HDL cholesterolu snižují: estrogen/progesteronová terapie, etretinát, hemodialýza, kouření, aj.
Koncentraci HDL cholesterolu zvyšují: estradiol, estrogen/progesteronová terapie, etanol, gravidita, intralipid, kyselina nikotinová, omega-3-mastné kyseliny, aj.