citronan, citran; citrate

Stanovení se může provádět v séru, plazmě (antikoagulans heparin nebo EDTA), moči (látková koncentrace nebo odpad), případně v likvoru. Stabilita v séru nebo plazmě: při 20 – 25 °C 1 d, při 4 – 8 °C 5 d, při -20 °C 1 rok. Stabilita v moči (po úpravě pH na < 1,7 pomocí 6 M HCl) při 20 – 25 °C 1 d, při -20 °C 1 měsíc. Stabilita v likvoru: při 20 – 25 °C 1 d, při 4 – 8 °C 5 d, při -20 °C 3 roky.

Z metod používajících enzymy byly navrženy postupy s akonitázou (EC 4.2.1.3), izocitrátdehydrogenázou (EC 1.1.1.42), citrátlyázou (EC 4.1.3.6) a oxalacetátdekarboxylázou (EC 4.1.1.3).

Nejvíce je používaná reakční kaskáda s využitím tří enzymů: citrátlyázy, malátdehydrogenázy (EC 1.1.1.37) a laktátdehydrogenázy (EC 1.1.1.27). V prvním stupni se citrát dehydratuje a rozkládá na oxalacetát a acetát. Oxalacetát se pak spontánně dekarboxyluje na pyruvát, ale ne úplně. Proto se používají obě dehydrogenázy spřažené s oxidací NADH na NAD⁺: oxalacetát se redukuje malátdehydrogenázou na malát a pyruvát se redukuje laktátdehydrogenázou na laktát. Při reakci se sleduje pokles absorbance při 340 nm. Praktická aplikace je dvousložková. Napřed se inkubací se všemi reagenciemi kromě citrátlyázy zajistí odstranění endogenního oxalacetátu a pyruvátu a následně se přidá citrátlyáza a sleduje se kinetika reakce. Při analýze séra nebo plazmy předchází vlastní analýze ještě deproteinace. Při analýze moče se upraví pH na hodnotu 8. Rozsah měření v séru 0,170 – 3,4 mmol/l (koncentrace > 2,7 mmol/l nutno ředit). Preciznost v sérii 3,0 – 8,4 %, zpětný výtěžek 98,6 – 100,1 %. Pyruvát lze také oxidovat pyruvátoxidázou za vzniku H₂O₂, který se 4-aminoantipyrinem v přítomnosti peroxidázy poskytuje se substituovaným fenolem nebo anilinem barevný produkt (Trinderova reakce), a ten se detekuje při 570 nm (někdy 546 nm) fotometricky, nebo po osvitu 535 nm fluorimetricky při 587 nm.

Kapilární elektroforéza moče probíhá v elektrolytu obsahujícím 10 mmol/l chromanu sodného a 0,5 mmol/l tetradecylamonium bromidu. Separace probíhá v kapiláře 600 x 0,075 mm při konstantním proudu 25 µA a napětí 15 – 18 kV. Detekce citrátu byla prováděna UV detektorem při 254 nm (migrační čas 4,6 min). Rozsah metody je 0 – 4,1 mmol/l. Preciznost v sérii 0,4 – 1,0 %, mezi sériemi 1,1 – 3,2 %; zpětný výtěžek 96,7 – 102,7 %.

Izotachoforéza používá jako vedoucí elektrolyt 10 mmol/l HCl + 5,5 mmol/l 1,3-bis[tris(hydroxymetyl)metylamino]propan + 0,1 % hydroxypropylmetylcelulózu (pH 6,2). Koncový elektrolyt obsahuje 10 mmol/l morfolinetansulfonové kyseliny. Hnací proud je na počátku 80 µA, na konci 30 µA. Doba analýzy 15 min. Detekční limit je 0,41 mmol/l citrátu.

LC-MS/MS je zvláště vhodná pro stanovení v moči. Analýza se provádí v izokratickém režimu na koloně C18 s mobilní fází voda s příměsí 2 mmol/l octanu amonného a 0,1 % kyseliny mravenčí. Retenční čas pro citrát je stejný jako pro jeho tetradeuterovaný vnitřní standard (1,4 min). Délka jednoho analytického cyklu je 4 min. Tandemový hmotnostní spektrometr sleduje přechody pro citrát m/z 191→111 a D4-citrát 195→113. Metoda je použitelná v rozsahu 0,48 – 3,8 mmol/l citrátu s limitem detekce 0,024 mmol/l. Preciznost mezi sériemi je < 3 %.

Iontově výměnná chromatografie se musí vypořádat s tím, že citrát velmi málo absorbuje v UV oblasti. Jako mobilní fáze se používá 20 mmol/l NaOH protože citát vykazuje vysokou afinitu k anexové stacionární fázi. Analytická kolona 4x250 mm má průtok 2 ml/min a teplotu 30 °C. V izokratickém režimu je délka analytického cyklu 10 min. Vodivostní detektor sleduje potlačení vodivosti citrátem. Kalibrační křivka je v rozsahu 0,01 – 0,52 mmol/l. Přesnost v sérii je 0,16 – 0,91 %, mezi sériemi 0,49 – 1,94 %; zpětný výtěžek je 95,3 – 105,1 %.

Hodnota v séru se zvyšuje po krevní transfuzi.

V moči se zvyšuje při urolitiáze.