volné lehké řetězce imunoglobulinů; free light chains kappa lambda, FLC

Stanovení se provádí v séru, moči nebo likvoru. Nelze používat antikoagulační prostředky? Řada výrobců komerčních souprav použití plazmy připouští, i když se výsledky od stanovení v séru podle použitého antikoagulantu poněkud liší. Stabilita v séru při laboratorní teplotě 8 – 24 h, při 4 – 8 °C 7 d, při -20 °C 2 – 12 týdnů, při -80 °C 3 měsíce. Hodnoty volných lehkých řetězců v moči nekolísají tak významně jako v séru.

Sledují se řetězce kapa a lambda a také index kapa/lambda. Používají se protilátky proti vnitřním epitopům lehkých řetězců, které jsou v kompletní molekule imunoglobulinu nedostupné. Jedním z hlavních problémů stanovení je zkřížená reakce s lehkými řetězci navázanými v intaktních imunoglobulinových molekulách. Antiséra vůči volným lehkým řetězcům mají průměrnou zkříženou reakci 0,1 %, což je příčinou zmíněných obtíží (např. vzorek obsahující 10 mg/l volného lehkého řetězce kapa a 10 g/l paraproteinu IgG kapa při 0,1 % zkřížené reakci s vázanými lehkými řetězci kappa dává konečný výsledek volných lehkých řetězců kappa dvojnásobný, tj. 20 mg/l).

Turbidimetrie kapa Polyklonální kozí protilátky vůči FLC kappa reagují s antigenem ve vzorku a vytvářejí komplex antigen protilátka a následná aglutinace může být turbidimetricky změřena. Šestibodová kalibrace je v rozsahu 1 – 12 g/l FLC kappa při 340/800 nm. Detekční limit je 0,4 g/l. Stanovení neruší hemoglobin 10 g/l, bilirubin 1026 µmol/l ani RF < 500 kU/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevil do 20 g/l FLC kapa. Ve velmi vzácných případech může gamapatie, především u typu IgM (Waldenströmova makroglobulinémie), způsobit nespolehlivé výsledky. Preciznost v sérii 0,9 – 1,9 %, mezi sériemi 1,6 – 2,9 %. 

Turbidimetrie lambda Polyklonální kozí protilátky vůči FLC lambda reagují s antigenem ve vzorku a vytvářejí komplex antigen protilátka a následná aglutinace může být turbidimetricky změřena. Šestibodová kalibrace je v rozsahu 0,5 – 7,5 g/l FLC lambda při 340/800 nm. Detekční limit je 0,2 g/l. Stanovení neruší hemoglobin 10 g/l, bilirubin 1026 µmol/l ani RF < 450 kU/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevil do 30 g/l FLC lambda. Ve velmi vzácných případech může gamapatie, především u typu IgM (Waldenströmova makroglobulinémie), způsobit nespolehlivé výsledky. Preciznost v sérii 1,1 – 1,7 %, mezi sériemi 1,2 – 2,5 %.

Nefelometrie kapa Králičí protilátky vůči FLC kappa reagují s antigenem ve vzorku a vytvářejí komplex antigen protilátka a následná aglutinace může být po inkubaci 6 min při 37 °C nefelometricky změřena v režimu E.P. Sedmibodová kalibrace je v rozsahu 0,28 – 9,1 g/l (sérum), 8,5 – 380 mg/l (moč) FLC kappa při 840 nm (vyšší koncentrace lze ředit 5x). Detekční limit je 0,07 g/l (sérum) a 8,5 mg/l (moč). Stanovení neruší hemoglobin 10 g/l, bilirubin 1026 µmol/l ani RF < 872 kU/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevil do 47,6 g/l (sérum) a 5,7 g/l (moč) FLC kapa. Ve velmi vzácných případech může gamapatie, především u typu IgM (Waldenströmova makroglobulinémie), způsobit nespolehlivé výsledky. Preciznost v sérii 1,6 – 2,4 % (sérum), 3,4 – 5,3 % (moč), mezi sériemi 2,2 – 3,3 % (sérum), 5,9 – 6,0 (moč); zpětný výtěžek 102,2 – 106,9 % (sérum), 94,9 – 105,3 % (moč). Lipémie při stanovení ruší.

Při nefelometrii mohou být použité také polystyrénové latexové částice potažené specifickou protilátkou vůči FLC kapa.

Nefelometrie může být provedena také v kinetickém režimu. Používá se jeden kalibrátor a rozptýlené světlo se měří pod úhlem 90° při 670 nm (18 bodů v 5 s intervalech) v rozsahu 4 – 44 g/l, po úpravě ředění 0,111 – 264 g/l (sérum); 18,5 – 204 mg/l, po úpravě ředění 0,0185 – 264 g/l (moč) FLC kappa. Detekční limit je 0,111 g/l (sérum) a 18,5 mg/l (moč). Stanovení neruší hemoglobin 5 g/l, bilirubin 153 µmol/l ani triacylglyceroly 11,3 mmol/l. Preciznost v sérii 2,2 – 2,9 % (sérum), 1,3 – 2,5 % (moč), celková 2,8 – 3,2 % (sérum), 2,9 – 3,5 (moč). 

Nefelometrie lambda Králičí protilátky vůči FLC lambda reagují s antigenem ve vzorku a vytvářejí komplex antigen protilátka a následná aglutinace může být po inkubaci 6 min při 37 °C nefelometricky změřena v režimu E.P. Sedmibodová kalibrace je v rozsahu 0,19 – 4,15 g/l (sérum), 4,7 – 200 mg/l (moč) FLC lambda při 840 nm (vyšší koncentrace lze ředit 10x). Detekční limit je 0,048 g/l (sérum) a 4,7 mg/l (moč). Stanovení neruší hemoglobin 10 g/l, bilirubin 1026 µmol/l ani RF < 726 kU/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevil do 24,16 g/l (sérum) a 5,99 g/l (moč) FLC lambda. Ve velmi vzácných případech může gamapatie, především u typu IgM (Waldenströmova makroglobulinémie), způsobit nespolehlivé výsledky. Preciznost v sérii 3,5 – 5,4 % (sérum), 1,9 – 2,7 % (moč), mezi sériemi 4,0 – 5,9 % (sérum), 3,1 – 4,9 (moč); zpětný výtěžek 97,8 – 103,3 % (sérum), 99,0 – 102,4 % (moč). Lipémie při stanovení ruší.

Při nefelometrii mohou být použité také polystyrénové latexové částice potažené specifickou protilátkou vůči FLC lambda.

Nefelometrie může být provedena také v kinetickém režimu. Používá se jeden kalibrátor a rozptýlené světlo se měří pod úhlem 90° při 670 nm (18 bodů v 5 s intervalech) v rozsahu 1,8 – 14 g/l, po úpravě ředění 0,3 – 252 g/l (sérum); 50 – 389 mg/l, po úpravě ředění 0,05 – 84 g/l (moč) FLC lambda. Detekční limit je 0,3 g/l (sérum) a 50 mg/l (moč). Stanovení neruší hemoglobin 5 g/l, bilirubin 153 µmol/l ani triacylglyceroly 11,3 mmol/l. Preciznost v sérii 1,9 – 3,0 % (sérum), 1,2 – 3,0 % (moč), celková 2,2 – 3,2 % (sérum), 3,2 – 4,1 (moč).

IRMA se ¹²⁵I má spíše historický význam. Hlavně se stanovovaly řetězce kapa (senzitivita 0,25 mg/l) až v přebytku IgG 10000x – protože zvýšení koncentrace kapa bylo více specifické, než zvýšení koncentrace lambda. Bylo také popsané sendvičové IRMA stanovení s ³H-markerem. Jamky byly potažené IgG protilátkou specifickou vůči kapa-FLC, nebo lambda řetězcům. Po inkubaci 4 h se vzorkem se přidala biotinylovaná protilátka a následovala další inkubace 2 h, pak streptavidin 30 min a nakonec ³H-biotin přes noc.

ELISA kapa Mikrotitrační destičky jsou potažené myšími monoklonálními protilátkami vůči volným řetězcům kapa lidských imunoglobulinů. Standardy, 200x ředěné vzorky nebo kontroly se inkubují 60 min (třepání); promyjí 3x a přidá se biotinylovaná myší monoklonální protilátka a směs se inkubuje 60 min (třepání). Po promytí 3x, se přidá konjugát streptavidinu s křenovou peroxidázou a inkubuje 30 min (třepání); následuje promytí 3x a přidá se roztok tetrametylbenzidinu. Reakce probíhá ve tmě, zastaví se po 15 min kyselým stop činidlem a měříme do 5 min absorbanci žlutého produktu při 450/550-650 nm, která je přímo úměrná množství volných lehkých řetězců kapa. Analýza probíhá za laboratorní teploty. Šestibodová kalibrační křivka je v rozmezí 10 – 320 µg/l. Senzitivita metody je 6 µg/l. Dle potřeby lze dále ředit vzorky 10x nebo 100x a měřit až 32 mg/l FLC kapa. Preciznost v sérii 2 – 4 %, mezi sériemi 6,9 – 7,0 %; zpětný výtěžek 95,9 – 104,9 %, linearita ředění 83,7 – 90,5 %.

ELISA lambda Mikrotitrační destičky jsou potažené myšími monoklonálními protilátkami vůči volným řetězcům lambda lidských imunoglobulinů. Standardy, 200x ředěné vzorky nebo kontroly se inkubují 60 min (třepání); promyjí 3x a přidá se biotinylovaná myší monoklonální protilátka a směs se inkubuje 60 min (třepání). Po promytí 3x, se přidá konjugát streptavidinu s křenovou peroxidázou a inkubuje 30 min (třepání); následuje promytí 3x a přidá se roztok tetrametylbenzidinu. Reakce probíhá ve tmě, zastaví se po 15 min kyselým stop činidlem a měříme do 5 min absorbanci žlutého produktu při 450/550-650 nm, která je přímo úměrná množství volných lehkých řetězců lambda. Analýza probíhá za laboratorní teploty. Šestibodová kalibrační křivka je v rozmezí 17,5 – 560 µg/l. Senzitivita metody je 5 µg/l. Dle potřeby lze dále ředit vzorky 10x nebo 100x a měřit až 56 mg/l FLC lambda. Preciznost v sérii 3 – 6 %, mezi sériemi 5,9 – 6,8 %; zpětný výtěžek 97,2 – 104,8 %, linearita ředění 82,8 – 90,9 %.

Imunofixace Bílkoviny se separují elektroforézou. Antiséra proti vnitřním epitopům lehkých řetězců se nanesou na gel, nebo se přiloží ke gelu acetát celulózy, který je nasycený těmito protilátkami. Rychlost imunoprecipitační reakce pak záleží na koncentraci reaktantů, teplotě, zastoupení iontů a pH pufru. Gel se promyje, aby se vymyly nezreagované proteiny. Imunoprecipitáty (obvykle ve formě pásů) se vybarví. Místo elektroforézy lze použít také izoelektrickou fokusaci. Izoelektrická fokusace probíhá nejčastěji na polyakrylamidovém gelu s imobilizovaným pH gradientem případně v kapiláře s pH gradientem tvořeným směsí nízkomolekulárních amfolytů (obsahují kyselé i bazické funkční skupiny). Po aplikaci napětí pak putuje protein do místa svého izoelektrického bodu a na tomto místě se soustřeďuje, protože v tomto bodu se celkový náboj bílkoviny vynuluje. Volné lehké řetězce bývají pozorovány při imunofixační elektroforéze jako ostrý gradient, který nekoresponduje s gradientem kompletní molekuly paraproteinu.

Průkaz Bence-Jonesovy bílkoviny je termoprecipitace volných lehkých řetězců imunoglobulinů.

Interindividuální variace může být > 17 %.

Snížené hodnoty: při méně specifických postupech (imunoelektroforéza, imunofixace, termoprecipitace), v dětství.

Zvýšené hodnoty: Hladina FLC v séru zdravých jedinců stoupá s věkem, zřetelné zvýšení je pozorováno nad 80 let, zvýšená produkce polyklonálních imunoglobulinů, poškozená funkce ledvin.