tokoferol; tocopherol

Ze skupiny čtyř tokoferolů je nejvíce rozšířen D-α-tokoferol.

Systematický název: (2R)-2,5,7,8-tetramethyl-2-[(4R,8R)-4,8,12-trimethyltridecyl]-3,4-dihydro-2H-chromen-6-ol

Krev je třeba po odběru chránit před světlem. Minimální hodnoty jsou na jaře. Existuje inverzní závislost na okolní teplotě týden před odběrem. Sérum je třeba separovat do 2 h, chránit před světlem a pak je stabilní při 4 – 25 °C 15 – 30 d, jinde 20 – 25 °C 3 d, 4 – 8 °C 28 d, při -20 °C 5 – 12 měsíců. Stanovení lze provést i v likvoru nebo moči.

Fotometrie Chemické metody vychází z oxidačně-redukční reakce. Tokoferol je oxidován roztokem FeCl₃ v metanolu na tokoferylchinon a současně se redukuje Fe³⁺ na Fe²⁺, které se zapojuje do komplexu s α,α´-dipyridylem za vzniku červeného zbarvení. Takto se stanoví celkový tokoferol. Reakcí s HNO₂ (žluté zbarvení) lze stanovit non-α-formy a odečtením od výsledku pro celkový tokoferol pak zjistit množství α-tokoferolu. Fotometrické stanovení celkového tokoferolu se provádí v rozsahu 0 – 200 mg/l při 525 nm.

Citlivější postup používá rovněž oxidaci FeCl₃, ale redukované Fe²⁺ vytvářejí růžový komplex s 4,7-difenyl-10,10-fenantrolinem. Přídavek H₃PO₄ zabraňuje fotochemické redukci FeCl₃ a také zabraňuje interferenci karotenu. Bílkoviny ze séra se vysráží etanolem. Přidá se xylen, do kterého se extrahuje tokoferol. Po centrifugaci se horní xylenová vrstva odsaje a převede do jiné zkumavky. Přidá se postupně chromogen, FeCl₃ a ředěná H₃PO₄. Zbarvení se odečítá do 5 min při 536 nm proti xylenovému blanku. Rozsah měření je 0 – 240 mg/l.

Fluorimetrie Bílkoviny z likvoru se vysráží etanolem. Přidá se hexan, do kterého se extrahuje tokoferol. Po centrifugaci se horní hexanová vrstva odsaje a převede do jiné zkumavky a měří fluorimetrem (excitace 295 nm, emise 340 nm). Metoda je mnohem citlivější než fotometrie. Rozsah měření je 0,04 – 1,2 mg/l. Jiný postup měří při 330 nm a rozsah měření je 0,1 – 5 mg/l.    

ELISA na mikrotitračních destičkách je kompetitivní postup, kdy se do jamek potažených kozí protilátkou vůči králičímu IgG přidá vzorek nebo kalibrátor, specifická protilátka vůči vitaminu E a konjugát vitaminu Es křenovou peroxidázou. Po inkubaci (60min, 37 °C) a promytí 3x se přidá tetrametylbenzidin s H₂O₂. Roztok se inkubuje 15 min při 37 °C ve tmě; pak se pipetuje stop činidlo (0,5 M H₂SO₄). Absorbance při 450/540-570 nm se měří do 10 min a je nepřímo úměrná koncentraci vitaminu E ve vzorku. Na základě šestibodové kalibrace je rozsah metody 86 – 17421 mg/l. Mez detekce 43 mg/l. Preciznost v sérii je < 8 %, mezi sériemi < 10 %.

GC Při stanovení v moči se metabolity tokoferolu podrobí enzymové hydrolýze (β-glukuronidáza v acetátovém pufru) 4 h při 37 °C a okyselení (6 M HCl); poté se extrahují do éteru. Po centrifugaci se éterový extrakt oddělí, odpaří pod dusíkem. Extrakce se může provádět také do směsi n-hexan-dichlormetan 9:1. Odparek se 2x rozpustí a odpaří pod dusíkem v etanolu. Přidá se derivatizační roztok: N,O-bis(trimetylsilyl)acetamid, trimetylchlorsilan a N,O-bis(trimetylsilyl)trifluoracetamid a inkubuje se s odparkem 2 h při 50 °C za stálého třepání. Plynová chromatografie se provádí na kapilární koloně 30 m x 0,25 mm při 280 °C. Jako vnitřní standard se použije trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-karboxylová kyselina) – retenční čas 8,3 min. Retenční čas vzorku byl 11,4 min. Nosným plynem byl dusík a k detekci se používá plameno-ionizační detektor. Při stanovení v plazmě je kalibrace lineární v rozsahu 1 – 30 mg/l. Mez detekce je 0,3 mg/l, mez stanovitelnosti 0,35 mg/l. Preciznost je < 4 %, přesnost < 8 %; zpětný výtěžek 97,4 %.

HPLC Komerčně dostupná je souprava pro paralelní stanovení vitaminů A a E v plazmě nebo séru. Ke vzorku se pipetuje vnitřní standard a precipitační činidlo pro odstranění bílkovin (30 min 2 – 8 °C. Analýza supernatantu po centrifugaci se provádí na koloně 125x4 mm s reverzní fází C18 při 30 °C (průtok 0,8 – 1,2 ml/min) a jeden cyklus je 15 min. Vitamin E se stanovuje UV detektorem při 300 nm. Dostačující je jednobodová kalibrace pro měření vitaminu E 1 – 50 mg/l. Detekční limit je 1 mg/l. Preciznost v sérii je 1,1 – 1,5 %, mezi sériemi 4,6 -4,7 %; zpětný výtěžek 101 %. Nelze měřit hemolytické a lipemické vzorky.

Jiný postup používá gradient mobilní fáze acetonitril-vodný roztok octanu amonného při pH 7 a pro detekci 295 nm (1 cyklus 7,2 min). Standardem je syntetický tokoferol a metoda je lineární v rozsahu 0,2 – 21,5 mg/l.

Další postup používá jako vnitřní standard retinylacetát a poté denaturace bílkovin ve směsi metanol-etanol s butylovaným hydroxytoluenem jako stabilizátorem. Mobilní fáze metanol-voda 99:1 se použije v izokratickém modu. Před chromatografii se provede extrakce do směsi n-hexan-dichlormetan. Lze použít UV detekce při 292 nm, ale elektrochemický detektor 0,5 – 0,65 V je citlivější a preciznost je přitom 2 – 4,1 %.

LC-MS Používá se extrakce do éteru. Pro chromatografii kolona 150x18 mm (velikost zrna 3,5 µm). Gradientová eluce metanol-voda s 0,05 % kyselinou octovou – délka cyklu 18 min. Hmotový spektrometr s kvadrupólem a negativní ionizací elektrospreje, potenciál kapiláry 2500 V. Měřený signál m/z 277,8 (α-tokoferol) a m/z 263,8 (g-tokoferol). Rozsah měření 0,01 – 8,6 mg/l. Mez detekce 0,009 mg/l. Preciznost byla 1 – 3 %; zpětný výtěžek 77 – 87 %.

Interindividuální variace > 13 %.

Hodnoty snižuje: alkoholismus, kouření, abetalipoproteinémie, biliární atrézie, cystická fibróza, malabsorpce, citrát, β-karoten; léky: antikonvulsiva, etanol, fenobarbital, fenytoin, cholestyramin, karbamazepin, klofibrát.

Hodnoty zvyšuje: těhotenství, hyperlipidémie, jaterní obstrukce, selhání ledvin, věk (> 50let).