Hepatitis B Core Viral Antibody; Hepatitis B Core IgG/IgM Antibody; Hep B Core Ab Total, HEP B CORE AB, TOTAL ANTI-HBC, HBc Ab Total, HBC AB

Stanovení se provádí v séru (plazmě – antikoagulans EDTA, heparin, citrát). Stabilita za laboratorní teploty 2d, při 4 – 8 °C 7 d, při -20 °C dlouhodobě.

Všechny soupravy jsou určeny pro kvalitativní stanovení. I když mají některé v názvu uvedeno anti-HBc IgG (zejména ELISA), je to jen pro matení uživatelů – ve skutečnosti jsou všechny soupravy určeny pro průkaz celkových protilátek, tedy IgG + IgM.

RIA analýza se používá již omezeně, i když stále existují komerční soupravy na trhu. Obvykle se sleduje kompetitivní reakce mezi anti-HBc ze séra a anti-HBc značenými ¹²⁵I o vazebná místa na jaderném antigenu viru hepatitidy B, který je vázaný na stěně zkumavky. Radioaktivita je po vymytí nepřímo úměrná množství anti-HBc (IgG+IgM) v séru. Doba trvání analýzy je 120 min.

ELISA je kompetitivní jednokrokové imunochemické stanovení. Protilátka proti HBc obsažená ve vzorku a konjugát monoklonální protilátky vůči HBc/POD soupeří o vazbu na HBcAg fixovaném na povrch jamek mikrotitrační destičky. Inkubace 60 min při 37 °C (Je možné také sekvenční uspořádání, kdy se vzorek inkubuje 30 min, pak se promyje a přidá se konjugát s následnou inkubací 30 min).Po promytí 4x se přidá chromogen. Enzymová část konjugátu zbarví roztok tetrametylbenzidinu s H₂O₂ modře (18 – 25 °C, 30 min ve tmě). Tato reakce je zastavena přidáním zastavovacího roztoku (0,25 M H₂SO₄), který způsobí barevnou změnu na žlutou barvu. Na základě kompetitivního principu testu je intenzita zbarvení (450/615-690 nm) nepřímo úměrná koncentraci protilátek proti HBc přítomných ve vzorku. Absorbance negativní kontroly násobená 0,2 je cut-off (Jiná souprava používá pro výpočet cutoff průměr absorbance negativní a pozitivní kontroly; může se dodávat také indexový kalibrátor a cutoff je pak jeho absorbance x 0,3). Negativní výsledky > cutoff + 10 %, hraniční cutoff až cutoff + 10 %, pozitivní < cutoff. Preciznost v sérii je 3,9 – 13,6 %, mezi sériemi 5,6 – 15,3 %. Relativní senzitivita je 99,0 %, relativní specificita 99,7 %. U vzorků, které obsahují protilátky proti viru hepatitidy A, EBV, HIV, HCV a u lipemických či ikterických vzorků může být zjiš
eována zvýšená reaktivita. Vzorky pacientů po hemodialýze, po orgánové transplantaci, opakované krevní transfúzi a pacientů se zvýšenou hladinou jaterních aminotransferáz mohou vykazovat zvýšenou reaktivitu.

Chemiluminiscenční analýza v sendvičovém uspořádání používá rekombinantní jaderný antigen viru hepatitidy B zakotvený na paramagnetických částicích, ke kterému se přidává ředěný standard nebo vzorek. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá myší protilátka vůči lidskému HBc značená akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je přímo úměrná hladině anti-HBc a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Jednobodová kalibrace (v tripletu) slouží pro kvalitativní hodnocení. Vzorky, které mají index cut-off  (signál vzorku / průměrný signál kalibrátoru) ≥ 1,00 jsou reaktivní na anti-HBc, < 1,00 jsou nereaktivní. Preciznost v sérii je 2,52 – 6,52 %, celkově 2,87 – 7,57 %. Relativní senzitivita je 99,1 %, relativní specificita 98,4 %. Neruší hemoglobin 5 g/l, bilirubin 342 µmol/l ani triacylglyceroly 33,9 mmol/l.

CLIA je další kompetitivní dvojstupňový zábleskový postup, kdy anti-HBc ze vzorku se naváže během první inkubace (10 min) na magnetické částice potažené rekombinantním jaderným antigenem hepatitidy B. Pak se přidá monoklonální myší protilátka vůči HBc značená izoluminolem a proběhne další inkubace (10 min), kdy se obsadí zbývající volné epitopy antigenu HBc. Po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je nepřímo úměrná hladině anti-HBc IgG. Dva kalibrátory upravují vzorovou kalibrační křivku. Vzorky, které mají index cut-off  (signál vzorku / cut-off) ≥ 1,1 jsou nereaktivní na anti-HBc, < 0,9 jsou reaktivní, 0,9 – 1,1 jsou reaktivní v šedé zóně. Preciznost v sérii 3,7 – 12,4 %, mezi sériemi 5,6 – 17,9 %. Relativní senzitivita je 99,4 %, relativní specificita 99,2 %. Ani koncentrace hemoglobinu 1 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší.

Jiné stanovení je založeno na dvoukrokové imunochemické reakci se sledováním luminiscence zesílené enzymem. Protilátky vůči HBc ze vzorku v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin reagují s rekombinantním HBcAg imobilizovaným na polystyrénové kuličce; reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytím se na zbylá vazebná místa naváže monoklonální myší protilátka vůči jadernému antigenu hepatitidy B konjugovaná s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření 425 – 500 nm je nepřímo úměrná koncentraci anti-HBc ve vyšetřovaném vzorku. Používá se indexový kalibrátor (kalibrátor 2). Vzorky s indexem < 0,85 jsou nereaktivní, 0,85 až < 1,15 jsou neurčité, ≥ 1,15 jsou reaktivní. Pozor, kalibrátor je v tomto případě neobvykle v čitateli zlomku! Preciznost v sérii je 3,0 – 4,6 %, celková 5,7 – 8,5 %. Relativní senzitivita je 98,7 %, relativní specificita 100 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu 5,04 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 684 µmol/l neruší. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530 v dvoustupňové sekvenční reakci. Do zkumavky se pipetují paramagnetické částice potažené proteinem A. V dalším kroku se přidá standard nebo vzorek, roztok rhodanidu draselného s detergentem a rekombinantní HBcAg značený ALP. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je přímo úměrné množství anti-HBc. Doba analýzy je 30 min. Na základě kalibrace dvou standardů (oba se analyzují v tripletu) se vypočte hodnota cutoff. Výsledky s indexem < 0,9 jsou nereaktivní na anti-HBc, 0,9 až < 1,0 jsou neurčité, ≥ 1,0 jsou reaktivní na anti-HBc. Preciznost v sérii 2,3 – 6,9 %, mezi sériemi 4,8 – 7,5 %. Relativní senzitivita je 99,3 %, relativní specificita 99,5 %. Vysoké koncentrace hemoglobinu (10 g/l), bilirubinu (137 µmol/l) a triacylglycerolů (40,7 mmol/l) neruší při analýze. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

Chemiluminiscenční analýza v sekvenčním provedení, kdy se anti-HBc ze vzorku váže na rekombinantní HBcAg, kterým jsou potaženy jamky mikrotitrační destičky. Po inkubaci (37 °C) se promytím odstraní volný materiál a přidá se myší monoklonální protilátka vůči jadernému antigenu hepatitidy B značená křenovou peroxidázou. Po inkubaci (37 °C) se promytím odstraní volný materiál a přidá se luminogen (derivát luminolu + sůl peroxykyseliny) jehož oxidaci katalyzuje POD za vzniku světla. Celkově trvají inkubace 46 min a první výsledek je k dispozici za 55 min. Činidlo pro přenos elektronů (substituovaný acetanilid) zvyšuje hladinu uvolněného světla a prodlužuje jeho emisi. Signál je nepřímo úměrný koncentraci anti-HBc ve vzorku. Používá se indexový kalibrátor pro určení hodnoty cutoff. Výsledky s indexem ≥ 1,2 jsou nereaktivní (≥ 4,8 vyžadují ředění) na anti-HBc, ≥ 1,0 až < 1,2 jsou neurčité, < 1,0 jsou reaktivní na anti-HBc. Preciznost v sérii 1,9 – 11,0 %, mezi sériemi je 3,9 – 16,8 %. Relativní senzitivita je 98,5 %, relativní specificita 99,6 %. Vysoké koncentrace hemoglobinu (5 g/l), bilirubinu (342 µmol/l) a triacylglycerolů (33,9 mmol/l) neruší při analýze. Nelze použít zakalené vzorky. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v sekvenčním uspořádání trvá 27 min. Vzorek (50 µl) je inkubován s redukčním činidlem (1,4-dithiothreitol v citrátovém pufru). Pak se přidá rekombinantní HBcAg a provede se druhá inkubace. Před poslední inkubací se přidá biotinylovaná myší monoklonální protilátka vůči HBcAg značená ruthéniovým komplexem a paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem, na které se naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Po inkubaci se reakční směs nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Cutoff je stanoveno na základě dvoubodové kalibrace. Luminiscence je nepřímo úměrná hladině anti-HBc ve vzorku. Výsledky s indexem > 1,0 jsou nereaktivní na anti-HBc, ≤ 1,0 jsou reaktivní na anti-HBc. Preciznost v sérii 1,2 – 3,9 %, mezi sériemi 1,0 – 8,1 %. Relativní senzitivita 100 %, relativní specificita je 99,7 %. Hemolýza (hemoglobin 16 g/l), chylozita (triacylglyceroly 11,3 mmol/l), ikterus (bilirubin 428 µmol/l) a RF (< 676 kIU/l) neruší. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměli odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Vzácně mohou interferovat protilátky vůči streptavidinu nebo rutheniu.

Falešná pozitivita: u 3 % dětí nad 21 měsíců, abnormality spojené s jaterními enzymy.