vitamin B₁₂, kyanokobalamin, kobalamin; cyanocobalamin, cobalamin, anacobin, cyanocob III, Cb1;

α-(5,6-dimethylbenzimidazolyl) kobamidkyanid, α-(5,6-dimethylbenzimidazolyl)kyanokobamid

Stanovení se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans EDTA – ale ne vždy, heparin nebo citrát). Pokud se podává B₁₂, je nutné léčbu před odběrem na 2 dny přerušit. Stabilita v séru za laboratorní teploty 8 h – 3 d, při 4 °C 2 – 10 d, při -20 °C 2 měsíce. Stabilita v plazmě 15 min za laboratorní teploty, 4 h při 4 – 8 °C, 2 měsíce při -20 °C. Je třeba zabránit dlouhodobé expozici světla. Stanovení se provádí někdy také v erytrocytech.

Mikrobiologické metody jsou považované za referenční pro stanovení biologicky aktivního vitaminu B₁₂. Používá se Euglena gracilis, Lactobacillus leichmannii nebo mutant Escherichia coli. Bohužel všechny tyto organismy jsou velmi citlivé na antibiotika i jiné léky, např. metotrexát v séru. Navíc se vyžaduje alespoň 24 h pro odpovídající růst mikroorganismů.

RIA může stanovovat současně folát i B₁₂. Jako vazebná bílkovina se používá β-laktoglobulin (FBP) a v kompetitivní reakci konjugáty ¹²⁵I-folát a ⁵⁷Co-B₁₂. Analýza probíhá v roztoku obsahujícím ditiotreitol a KCN. Folát se uvolní z endogenních proteinů varem; v případě erytrocytů této operaci předchází jejich lýza (90 min) kyselinou askorbovou. Pak se přidává prasečí vnitřní faktor B₁₂ a FBP a konjugáty ¹²⁵I-folát a ⁵⁷Co-B₁₂. Proběhne inkubace 1 h za laboratorní teploty a následně centrifugace a dekantace. Imunokomplex zůstává na dně zkumavky ve formě sraženiny. Měří se radioaktivita gama-počítačem (1 min). Signál je nepřímo úměrný koncentraci B₁₂ ve vzorku. Rozsah měření na základě šestibodové kalibrace 15 – 1476 pmol/l (vyšší koncentrace se ředí 3x). Analytická citlivost je 15 pmol/l (některých soupravách až 1,1 pmol/l). Preciznost celkem 2,1 – 4,1 % (v sérii u jiné RIA soupravy 6,5 – 21,7 %). Hemolýza může falešně zvýšit výsledky.

K dispozici jsou také soupravy pouze pro stanovení B₁₂.

ELISA na mikrotitračních destičkách je kompetitivní postup, kdy se do jamek potažených streptavidinem přidá králičí IgG protilátka vůči B₁₂, vzorek nebo kalibrátor. Po inkubaci (45 min, laboratorní teplota) se přidá konjugát B₁₂ s křenovou peroxidázou. Po inkubaci (30 min, laboratorní teplota) a promytí 3x se přidá tetrametylbenzidin s H₂O₂. Roztok se inkubuje 20 min, pak se pipetuje stop činidlo (ředěná H₂SO₄). Absorbance při 450/620-630 nm se měří do 15 min a je nepřímo úměrná koncentraci B₁₂ ve vzorku. Na základě šestibodové kalibrace je rozsah metody 52 – 1476 pmol/l. Preciznost v sérii je 3,1 – 7,3 %, mezi sériemi 4,8 – 15,7 %.  Nelze použít silně lipemická a hemolytická séra. V některých soupravách interferuje hydroxykobalamin (29 %).

Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) probíhá tak, že se do reakční nádobky dávkuje vzorek, extrakční činidla (dikyanokobinamid v borátovém pufru s ptačím bílkovinným stabilizátorem a α-monotioglycerol v EDTA) a denaturant (0,8 M NaOH). Poté latexové mikročástice potažené prasečím vnitřním faktorem v komplexu s myšími monoklonálními protilátkami vůči vnitřnímu faktoru vitaminu B₁₂ a pufr. B₁₂ ze vzorku se naváže na vnitřní faktor. Reakční směs se přenese na skleněnou fritu, kde se ireverzibilně naváže a mikročástice se ještě promyjí, aby se odstranil nenavázaný materiál. Pak se přidá konjugát B₁₂ s ALP a obsadí zbylá volná místa vnitřního faktoru. Po inkubaci a promytí se dávkuje substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí na fluoreskující umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky. Šestibodová kalibrace je v rozsahu 62 – 885 pmol/l. Vzorky s koncentrací B₁₂ > 885 pmol/l se ředí manuálně 4x (do 3542 pmol/l). Preciznost v sérii je 2,2 – 6,7 %, celková preciznost metody je 2,9 – 10,2 %; zpětný výtěžek 85 – 115 %. Mez detekce 62 pmol/l, senzitivita je 32 pmol/l (2 SD nulového blanku). Ani vysoké koncentrace hemoglobinu (5 g/l), bilirubinu (342 µmol/l) a triacylglycerolů (11,3 mmol/l) neruší.

Chemiluminiscenční analýza v dvoukrokovém uspořádání začíná přípravným krokem, kdy se vzorek smíchá s extrakčními činidly (dikyanokobinamid v borátovém pufru s ptačím bílkovinným stabilizátorem a α-monotioglycerol v EDTA) a denaturantem (1 M NaOH).  Upravený vzorek se přenese do další zkumavky a přidá se vnitřní faktor zakotvený na paramagnetických částicích a borátový pufr. Po inkubaci a promytí se přidá konjugát B₁₂ s akridiniumkarboxamidem. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je nepřímo úměrná hladině folátu a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Metoda dovoluje měřit vzorky na základě šestibodové kalibrace v rozmezí hodnot 92 – 1476 pmol/l (Vzorky s hodnotami B₁₂ > 1476 pmol/l lze automaticky 3x nebo manuálně ředit 4x; po ředění musí být hodnota > 61 pmol/l). Senzitivita 61 pmol/l, mez stanovitelnosti 92 pmol/l). Preciznost v sérii je 2,7 – 5,6 %, celkově 3,4 – 6,8 %. Ani vysoké koncentrace bilirubinu (429 µmol/l) a triacylglycerolů (37,5 mmol/l) neruší. Hemolytické vzorky se nesmí používat. Při reakci mohou interferovat heterofilní protilátky a RF. Kromě celkového vitaminu B₁₂ lze stanovit také jeho aktivní složku, která je vázaná na transkobalamin, tzv. holotranskobalamin. V tomto případě jsou na částicích navázané myší monoklonální protilátky vůči holotranskobalaminu. Na ně se váže stanovovaný holotranskobalamin a pak konjugát myších monoklonálních protilátek vůči holotranskobalaminu s akridiniumkarboxamidem. Chemiluminiscence je v tomto případě přímo úměrná koncentraci holotranskobalaminu (kalibrační rozmezí do 128 pmol/l).

Podobný princip zábleskové luminiscence lze použít s esterem akridinu jako značkou. Vzorek se denaturuje 0,4 M NaOH. Pak se přidá ditiotreitol a paramagnetické latexové částice potažené prasečím vnitřním faktorem. Směs se inkubuje 5 min při 37 °C. Přidá se B₁₂ značený esterem akridinu a inkubuje 2,5 min při 37 °C. Po odsátí roztoku a promytí zkumavek se přidá peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk fotonásobičem při 429 nm. Rozsah kalibrace na základě dvou standardů je 33 – 1476 pmol/l. Luminiscence záblesku je nepřímo úměrná koncentraci B₁₂. Vzorky s koncentrací B₁₂ > 1476 pmol/l se ředí diluentem automaticky 2x nebo 10x. Analytická citlivost je 33 pmol/l. Preciznost v sérii 2,4 – 5,0 %, mezi sériemi 2,7 – 9,2 %. Linearita ředění je 81,6 – 123,7 %, zpětný výtěžek 89,2 – 111,8 %. Triacylglyceroly (33,9 mmol/l), hemoglobin (1,5 g/l) a bilirubin (342 µmol/l) neruší.

Jiné stanovení CLIA je založeno na kompetitivní imunochemické reakci s luminiscencí zesílenou enzymem. B₁₂ (ze séra, heparinizované plazmy) je uvolněn z endogenních proteinů ditiotreitolem v prostředí pufrovaného roztoku a roztokem NaOH + KCN (inkubace 30 min, 37 °C). Upravený vzorek se pipetuje do další zkumavky, kde dochází ke kompetici o vazebná na prasečím vnitřním faktoru mezi B₁₂ ze vzorku a analogem B₁₂ imobilizovaným na polystyrenové kuličce. Reakce probíhá 30 minut při 37 °C. Dále se přidá konjugát protilátky vůči vnitřnímu faktoru s navázanou ALP a inkubuje se 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se ihned rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita vzniklého záření 425 – 500 nm je nepřímo úměrná koncentraci B₁₂ ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Rozsah měření je 111 – 738 pmol/l. Analytická citlivost 92 pmol/l. Preciznost v sérii 6,7 – 13,0 %, mezi sériemi 6 % – 15 %; linearita ředění 89 – 110 %, zpětný výtěžek 92 – 123 %. Hemoglobin (4,17 g/l), bilirubin (342 µmol/l) a triacylglyceroly (45,2 mmol/l) neruší. Při reakci mohou interferovat heterofilní protilátky. EDTA plazma se pro stanovení nedoporučuje. U pacientů se zhoubnou anémii se mohou vyskytnout blokující protilátky vůči vnitřnímu faktoru.

Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530. Do zkumavky se pipetuje standard nebo vzorek obsahující B₁₂ (uvolněný z endogenních vazebných proteinů ditiotreitolem, NaOH a KCN s následnou neutralizací), konjugát prasečího vnitřního faktoru s ALP, paramagnetické částice potažené kozí protilátkou vůči myšímu IgG a myší monoklonální protilátkou vůči vnitřnímu faktoru. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je nepřímo úměrné množství B₁₂. Rozsah měření při 470 nm na základě šestibodové kalibrace je 37 – 1107 pmol/l. (po ředění 5x nulovým kalibrátorem do 5533 pmol/l). Analytická citlivost 37 pmol/l. Preciznost v sérii 4,8 – 11,4 %, celkově 6,6 – 11,4 %; zpětný výtěžek 88 – 108 %, linearita ředění je 96 – 120 %. Křížová reaktivita do 0,5 %. Neruší bilirubin 171 µmol/l a triacylglyceroly 20,3 mmol/l. Při reakci mohou interferovat heterofilní protilátky. U pacientů se zhoubnou anémii se mohou vyskytnout blokující protilátky vůči vnitřnímu faktoru.

Homogenní chemiluminiscenční imunoanalýza v kompetitivním uspořádání je založena na technologii LOCI. Stanovení se provádí v síru nebo heparinizované plazmě. Reagencie LOCI zahrnují dvě syntetické částicové reagencie a značený protein vážící folát (FBP). První částicová reagencie (Chemibeads) je potažena derivátem B₁₂ a obsahuje chemiluminiscenční barvivo. Druhá částicová reagencie (Sensibeads) je pokryta streptavidinem a obsahuje fotosenzitivní barvivo. Dříve, než je spuštěna imunologická část reakce, je pacientský vzorek předběžně zpracován NaOH, KCN a ditioerytritolem (DTE) za účelem uvolnění B₁₂ z endogenního proteinu. Po předběžném zpracování vzorků jsou postupně přidány do reakční nádobky biotinylovaný vnitřní faktor a reagencie Chemibeads. B₁₂ ze vzorku a B₁₂ z Chemibeads soutěží o volná místa na biotinylovaném vnitřním faktoru. Poté jsou přidány reagencie Sensibeads, navážou se na biotinylovanou část vnitřního faktoru a vytvoří částicové párové imunokomplexy. Iluminací komplexů světlem vlnové délky 680 nm se z reagencií Sensibeads uvolní singletový kyslík, který difunduje do reagencií Chemibeads a spustí chemiluminiscenční reakci. Výsledný signál se měří při vlnové délce 612 nm a představuje inverzní funkci koncentrace B₁₂ ve vzorku. Analýza trvá 32 min při 37 °C. Rozsah metody na základě šestibodové kalibrace je 44 – 1476 pmol/l (automatické ředění umožňuje zvětšit rozsah měření 3x). Analytická citlivost je 21 pmol/l, funkční citlivost 44 pmol/l. Preciznost v sérii 1,2 – 4,0 %, mezi sériemi 1,9 – 7,6 %; zpětný výtěžek 92,0 – 108,8 %. Triacylglyceroly 33,9 mmol/l a bilirubin 1026 µmol/l neruší. Při stanovení výrazně interferuje hemoglobin (5 g /l +19,8 %), dextran 40 (1500 µmol/l -11,9 %). Při reakci mohou interferovat heterofilní protilátky. U pacientů se zhoubnou anémii se mohou vyskytnout blokující protilátky vůči vnitřnímu faktoru.

Jiná chemiluminiscenční analýza v kompetitivním provedení je, když B₁₂ ze vzorku (B₁₂ z endogenních proteinů se předtím uvolní alkalickou denaturací a stabilizuje neutralizací) soutěží s B₁₂ značeným křenovou peroxidázou o omezený počet vazebných míst na biotinylovaném vnitřním faktoru. Imunokomplex se naváže na jamky potažené streptavidinem. Po inkubaci (48 min při 37 °C včetně denaturace) se promytím odstraní volný materiál a přidá se luminogen (derivát luminolu + sůl peroxykyseliny) jehož oxidaci katalyzuje POD za vzniku světla. Analýza trvá celkem 57 min. Činidlo pro přenos elektronů (substituovaný acetanilid) zvyšuje hladinu uvolněného světla a prodlužuje jeho emisi. Signál na základě dvoubodové kalibrace je nepřímo úměrný koncentraci B₁₂ ve vzorku. Rozsah měření 117 – 738 pmol/l. Ředění vyšších koncentrací B₁₂ před stanovením se nedoporučuje. Analytická senzitivita 68,6 pmol/l, funkční senzitivita 117 pmol/l. Preciznost v sérii 1,1 – 3,1 %, mezi sériemi je 4,1 – 10,0 %. Nelze použít zakalené vzorky. Bilirubin 340 µmol/l, hemoglobin 15 g/l a triacylglyceroly 33,9 mmol/l neruší. Křížová reakce: kobinamid dikyanid. Hladiny biotinu zůstávají v séru zvýšené 24 h po podání. Reakce se může provádět také postupně. Napřed se přidá biotinylovaná protilátka vůči B₁₂ a po inkubaci 45 min se přidá konjugát B₁₂-POD a opět se inkubuje 30 min.

ECLIA Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou v kompetitivním uspořádání trvá 27 min. Vzorek (15 µl) se inkubuje s ditiotreitolem v prostředí pufrovaného roztoku a roztokem NaOH + KCN (B₁₂ se uvolní z endogenních vazeb na proteiny). Pak se přidá vnitřní faktor značený ruthéniovým komplexem a následuje druhá inkubace. Poté se pipetuje biotinylovaný B₁₂ a paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem; imunokomplex je vázán na pevnou fázi pomocí biotin-streptavidinové kotvy. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Luminiscence je nepřímo úměrná koncentraci B₁₂ ve vzorku. Triacylglyceroly (17,1 mmol/l), bilirubin (1112 µmol/l), hemoglobin (10 g/l) a RF (< 1500 kIU/l) neruší. Od pacientů léčených vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměly odebírat vzorky dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Metoda je použitelná v rozsahu 22 – 1476 pmol/l. Vyšší koncentrace - vzorky se ředí manuálně 2x (rozsah do 2992 pmol/l). Detekční limit 22 pmol/l. Preciznost v sérii CV 1,7 – 5,9 %, mezi sériemi 2,3 – 10,3 %. Ruší velmi vysoké hodnoty protilátek vůči streptavidinu a rutheniu.

HPLC se provádí na reverzní fázi C18 na koloně 250x2,1 mm (velikost zrna 5 µm) v kombinovaném režimu izokratické a lineární gradientové eluce (0,01 % vodný roztok trifluoroctové kyseliny – 100 % metanol). Analýza trvá 35 min a umožňuje stanovit vitaminy C, B₁, B₂, B₅, B₆, B₉ a B₁₂ detektorem s diodovým polem (280 nm pro B₁₂). Doba analýzy je 35 min. Preciznost v sérii < 4 %, mezi sériemi < 7 %; zpětný výtěžek 93 – 100 %

LC-MS Umožňuje vedle sebe stanovit vitaminy B₅, B₈, B₉ a B₁₂. Pro kapalinovou chromatografii se použila reverzní fáze C18 s kolonou 100x2,1 mm (velikost zrna 1,7 µm) s mobilní fází acetonitril-voda s gradientovou elucí při 35 °C. Pro detekci B₁₂ se používá přechod m/z 678,9 → 147,0 (vnitřní standard metotrexát 455,5). Mez detekce 14 pmol/l B₁₂. Rozsah měření 73,8 – 7380 pmol/l. Hmotnostní spektrometr s trojitým kvadrupólem používal elektrosprej (napětí v kapiláře 3500 V) v MRM (multiple reaction monitoring) uspořádání. Preciznost v sérii < 6,9 %, mezi sériemi < 12,3 %. Zpětný výtěžek pro B₁₂ byl 86,0 – 99,9 %.

Mezinárodní standard pro folát a vitamin B₁₂ ze 4. 4. 2008 nese označení WHO International Standard NIBSC 03/178.

Toleranční limit EHK: 20 %.

Hodnoty snižuje: malnutrice, malabsorpce B₁₂, alkoholismus, perniciózní anémie, celiakie, vrozený deficit transkobalaminu II, gastrektomie, chronická atrofická gastritida, regionální ileitida, hypertyreóza, sprue, deficit vnitřního faktoru, věk > 60 let, těhotenství, kuřáci, vegetariáni, vegani; léky: aminoglykosidy, antikonvulsiva, belomet, cimetidin, fenformin, fenobarbital, fenytoin, framykoin, cholestyramin, kolchicin, kyselina acetylsalicylová, kyselina aminosalicylová, kyselina askorbová, metformin, metotrexát, neomycin, nitroprusid, pentamidin, perorální kontraceptiva, primidon, ranitidin, tagamet, trankvilizery, triamteren.

Hodnoty zvyšuje: obezita, závažná dystrofie jater, jaterní nádory, po krevní transfúzi, přítomnost analogů B₁₂ v séru; běloši mají vyšší hodnoty než černoši.