SHBG, vazebný globulin pro pohlavní steroidní hormony;

sex hormon-binding globulin, testosteron-estradiol binding globulin, sex steroid-binding globulin, SSBG.

Stanovení se provádí v séru nalačno. Odběr do EDTA není vhodný, heparinát lithný lze použít. Sérum je stabilní při laboratorní teplotě i při 4 – 8 °C 3 – 8 d, při -20 °C 1 – 8 měsíců. Vrcholné koncentrace SHBG jsou časně odpoledne, minima kolem půlnoci. Opakované rozmrazování se nedoporučuje.

IRMA je dvoukrokový sendvičový postup, který začíná pipetováním séra a diluentu do zkumavek potažených myší monoklonální protilátkou vůči SHBG. Roztoky se promíchají a inkubují 60 min při 18 – 25 °C za stálého třepání. Pak se roztok odsaje a zkumavky se promyjí. Přidá se druhá myší monoklonální protilátka vůči SHBG značená ¹²⁵I. Po inkubaci (60 min při 18 – 25 °C za stálého třepání) se supernatant odsaje a zkumavky se promyjí. Navázaná aktivita se změří gama-počítačem (1 min). Na základě šestibodové kalibrace je rozsah metody 0,1 – 300 nmol/l; analytická citlivost 0,1 nmol/l, funkční citlivost 0,41 nmol/l.  Preciznost v sérii je < 6,1 %, mezi sériemi < 8,6 %. Linearita ředění 91,6 – 111 %, zpětný výtěžek 94,6 – 118 %. Nepoužívejte hemolytické, ikterické ani lipemické vzorky. U stanovení využívajících protilátky existuje možnost interference heterofilních protilátek přítomných v pacientském vzorku.

ELISA používá dvou monoklonálních myších protilátek: jedna je značená křenovou peroxidázou a druhá je zakotvená v jamkách mikrotitrační destičky. Do mikrotitrační destičky se pipetuje vzorek a inkubuje se 30 min (třepání). Po promytí (3x) se přidá konjugát myší monoklonální protilátky s peroxidázou a inkubuje se 15 min (třepání). Po trojnásobném propláchnutí se přidá substrát tetrametylbenzidin a inkubuje se 10 – 15 min (třepání). Pak se přidá stop činidlo (1 M H₂SO₄) a měří se při 450 nm do 20 min, kdy absorbance je přímo úměrná koncentraci SHBG. Je-li absorbance příliš vysoká, lze použít filtr 405 nebo 415 nm. Celý postup se realizuje za laboratorní teploty. Šestibodová kalibrace umožňuje měření v intervalu 0,1 – 295 nmol/l (vyšší koncentrace se ředí nulovým kalibrátorem 10x). Mez detekce je 0,1 nmol/l. Preciznost v sérii je 3,0 – 8,6 %, mezi sériemi 7,2 – 11,6 %; zpětný výtěžek 92,3 – 113,2 %, linearita ředění 96,6 – 117,1 %. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 10000 nmol/l. Silná hemolýza, lipémie a ikterus ruší analýzu. Reagencie nutno skladovat při 2 – 8 °C.

DELFIA je heterogenní fluorescenční imunoanalýza, kde prodloužená fluorescence Eu³⁺ je zesílena speciálním roztokem, který uvolňuje Eu³⁺ do roztoku a současně tvoří jeho ochranný chelát. Na mikrotitračních destičkách je zakotvena myší monoklonální protilátka vůči SHBG. V sendvičovém uspořádání se pipetuje SHBG ze vzorku a myší monoklonální protilátka značená Eu³⁺. Po inkubaci (120 min, třepání) a promytí se přidá zesilovací roztok; reakční směs se třepe 5 min a celý postup probíhá za laboratorní teploty. Fluorescence (excitace 340 nm, emise 615 nm) je přímo úměrná koncentraci SHBG ve vzorku a měří se do 1 h. Analytická citlivost je 0,5 nmol/l. Rozsah metody na základě šestibodové kalibrace 0,5 – 200 nmol/l.Preciznost v sérii je 4,9 %, mezi sériemi 7,2 %.

Chemiluminiscenční analýza v sendvičovém uspořádání používá monoklonální myší protilátku vůči SHBG zakotvenou na paramagnetických částicích, ke které se přidává ředěný standard nebo vzorek. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá myší monoklonální protilátka vůči SHBG značená akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je přímo úměrná hladině SHBG a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Metoda dovoluje měřit vzorky na základě šestibodové kalibrace v rozmezí hodnot 0,02 – 250 nmol/l (Vzorky s hodnotami SHBG > 250 nmol/l lze ředit automaticky nebo manuálně 5x). Preciznost v sérii je 4,8 – 5,3 %, celkově 5,7 – 9,6 %. Zpětný výtěžek 99 %, linearita ředění 96 – 103 %. Analytická senzitivita (2 SD nulového kalibrátoru) 0,02 nmol/l (?). Ani vysoké koncentrace hemoglobinu (5 g/l), bilirubinu (342 µmol/l) a triacylglycerolů (45,2 mmol/l) neruší. U stanovení využívajících protilátky existuje možnost interference heterofilních protilátek přítomných v pacientském vzorku.

Podobný princip zábleskové luminiscence lze použít s esterem akridinu jako značkou. Ke vzorku ředěného pacientského séra se přidá fragment F(ab)₂ monoklonální myší protilátky vůči SHBG, značený esterem akridinu a fragment F(ab)₂ biotinylované monoklonální myší protilátky vůči SHBG. Po inkubaci 6,3 min při 37 °C se přidají paramagnetické částice latexové částice s kovalentně vázaným streptavidinem ve fosfátovém pufru hovězího sérového albuminu. Po inkubaci 3,0 min při 37 °C následuje odsátí roztoku a promytí zkumavek. Pak se přidá peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk fotonásobičem při 429 nm na základě šestibodové kalibrace v rozmezí 1,7 – 180 nmol/l. Vzorky s koncentrací SHBG > 180 nmol/l se ředí manuálně. Analytická citlivost je 1,7 nmol/l. Preciznost v sérii 2,9 – 4,5 %, mezi sériemi 4,7 – 8,2 %. Linearita ředění je 97– 114 %, zpětný výtěžek 94 – 101 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu (5 g/l), bilirubinu (342 µmol/l) a triacylglycerolů (11,3 mmol/l) neruší. Efekt nadbytku antigenu se při měření může projevit kolem 1000 nmol/l.

Jiné stanovení je založeno na sendvičové imunochemické reakci se sledováním luminiscence zesílené enzymem. SHBG se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váže na myší monoklonální protilátku vůči SHBG imobilizovanou na polystyrénové kuličce a současně se na druhé vazebné místo SHBG naváže polyklonální králičí protilátka vůči SHBG konjugovaná s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření 425 – 500 nm je přímo úměrná hladině SHBG ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Rozsah kalibrace je do 180 nmol/l (při vyšších koncentracích se ředí diluentem), avšak do hodnoty 35000 nmol/l nebyl pozorován efekt nadbytku antigenu. Analytická citlivost je 0,02 nmol/l. Preciznost v sérii 2,3 – 5,3 %, mezi sériemi 4,0 – 6,6 %; zpětný výtěžek 89 – 100 %, linearita ředění 94 – 116 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu (3,8 g/l), bilirubinu (342 µmol/l) a triacylglycerolů (5,6 mmol/l) neruší. U stanovení využívajících protilátky existuje možnost interference heterofilních protilátek přítomných v pacientském vzorku.

Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530. Do zkumavky se pipetuje standard nebo vzorek obsahující SHBG a paramagnetické částice potažené myší monoklonální protilátkou vůči SHBG. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Přidá se druhá monoklonální myší protilátka vůči SHBG značená ALP. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je přímo úměrné množství SHBG. Reagencie se musí skladovat při 2 – 10 °C. Rozsah měření při 470 nm na základě šestibodové kalibrace je 0,33 – 200 nmol/l. (po ředění 10x promývacím pufrem až do 2000 nmol/l). Analytická citlivost 0,02 nmol/l, funkční citlivost 0,33 nmol/l . Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 49500 nmol/l. Preciznost v sérii je 4,5 – 4,8 %, celková 5,2 – 5,5 %. Zpětný výtěžek je 92 – 108 %, linearita ředění 96 – 106 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (10 µl) je inkubován s biotinylovanou monoklonální myší protilátkou vůči SHBG a monoklonální myší protilátkou vůči SHBG značenou ruthéniovým komplexem. Pak se přidají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem, na který se naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Luminiscence je přímo úměrná hladině SHBG ve vzorku. Metoda je použitelná v rozsahu 0,35 – 200 nmol/l. Ředění při vyšších koncentracích 10x umožňuje stanovit 2000 nmol/l SHBG. Analytická citlivost (2 SD nulového kalibrátoru) je 0,35 nmol/l. Preciznost v sérii 1,1 – 2,7 %, mezi sériemi 1,8 – 5,6 %. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměli odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 1000 nmol/l. Reagencie nutno skladovat při 2 – 8 °C. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu (29 g/l), bilirubinu (1026 µmol/l) a triacylglycerolů, (30,5 mmol/l) a RF (< 1160 kU/l) neruší. Ve vzácných případech je možné pozorovat interferenci způsobenou velmi vysokým titrem protilátek vůči streptavidinu nebo rutheniu.

K dispozici je WHO International Standard 2nd International Standard for Sex Hormone Binding Globulin NIBSC code: 08/266; Version 2.0, 28/03/2013.

Toleranční limit EHK: 20 %.

Hodnoty snižuje: obezita, tělesné cvičení, menopauza, u novorozenců, gravidní kuřačky, vegetariánky, alkoholismus; léky: androgeny, DHEA, růstový hormon, SHBG, testosteron.

Hodnoty zvyšuje: hubnutí u obézních, těhotenství, po porodu, prepubertálně, hladovění, ve stáří, kuřáci, vegetariáni, redukce hmotnosti; léky: antiepileptika, estradiol, tyroidní hormony.