Treponema pallidum, lues;

syphilis, syph, pox.

Odběr srážlivé krve se provádí nalačno. Nelze použít plazmu (?). Metoda ELISA běžně používá plazmu (antikoagulancia EDTA, citrát, heparin). Stanovení se provádí někdy také v likvoru. Sérum je stabilní 1 – 5 d při laboratorní teplotě, 3 – 14 d při 2 – 8 °C, 1 – 12 měsíců při -20 °C. Likvor je stabilní 2 d při laboratorní teplotě, 2 týdny při 2 – 8 °C, 1 rok při -20 °C.

Rychlá reaginová reakce (RRR): někdy označovaná jako RPR (rapid plasma reagin) je makroskopický test vyvločkování netreponemových bakterií a titraci reaginů (cirkulujících protilátek vznikajících při poškození tkání touto nemocí) v séru nebo plasmě. Antigen používaný v soupravě je modifikací VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) antigenu. Sestává z koloidní suspenze kardiolipinu v rovnováze s lecitinem a cholesterolem, promíchané s mikročásticemi uhlíku. V přítomnosti reaginů dochází k aglutinaci, které je zesílena přítomností mikročástic uhlíku. Reagin se může použít také bez tepelné úpravy (unheated serum reagin – USR) nebo toluidinovou červení (toluidine red unheated serum test – TRUST). Zpracovávají se neředěné vzorky. V kvalitativní variantě se na testovací kroužek karty dávkuje 1 kapka séra nebo plazmy. Pomocí plochého konce jednoúčelové pipety se rozetře vzorek po celé ploše kruhu. Takto se nanesou i další vzorky. Dávkovací jehla se umístí kolmo proti kartě s testovacími kroužky a na každý vzorek se nechá dopadnout jedna kapka antigenu. Testovací karta se pak otáčí rychlostí 100 ot/min po dobu 8 min na mechanickém rotoru. Poté se ještě karta otáčí ručně nahoru a dolů a naklání se, aby se odlišily nereaktivní a reaktivní výsledky. Výsledky se odečítají při dobrém osvětlení. Negativní kontrola vykazuje negativní reakci s reaginovým antigenem. Výsledky mohou být falešně pozitivní při lepře, infekční mononukleóze a autoimunitních onemocněních. Kvantitativní provedení je ve fosfátovém pufru a přidávají se latexové částice potažené antigeny kardiolipinu a lecitinu. Při stanovení se používají arbitrární jednotky a šestibodová kalibrace. Interferuje lipémie a gamapatie IgM, ale neruší bilirubin 320 µmol/l, hemoglobin 4,8 g/l a RF 470 kU/l. Efekt nadbytku antigenu může způsobit falešně nižší pozitivitu. Preciznost v sérii je 0,6 – 1,8 %, mezi sériemi 5,3 -8,0 %. Klinická senzitivita je 99,5 %, klinická specifita je 99,5 %. 

Latexová aglutinace TPLA nebo TP-PA je metoda pro kvantitativní stanovení protilátek vůči Treponema pallidum. Ke vzorku se přidá fosfátový pufr a latexové částice potažené antigenem odvozeným z Treponema pallidum (Nicholsův kmen), reagují na treponemové protilátky v séru a dochází k aglutinaci. Tento precipitát způsobuje zvýšení zákalu reakční směsi, které může být měřeno jako absorbance při 700 nm použitím fotometru. Titr protilátek proti treponemě ve vzorku může být stanoven měřením zákalu ve 2 různých intervalech po zahájení reakce. Reakce probíhá 10 min, používají se arbitrární jednotky. Stanovení neruší bilirubin do 342 µmol/l, hemoglobin do 4,7  g/l, RF do 500 kU/l. Gamapatie IgM může způsobit interferenci. Preciznost v sérii 2,4 – 3,2 %, mezi sériemi 2,5 – 4,4 %. Klinická senzitivita 100 %, klinická specifita 99,6 %. Test může být i jako kvalitativní a částice mohou být z barevné želatiny. Průkaz je jednodušší a levnější než FTA-ABS – odečítání vizuálně.

Nepřímá hemaglutinace (TPHA): pro detekci a titraci specifických protilátek proti Treponema pallidum. Ptačí erytrocyty (lze použít i ovčí nebo lidské erytrocyty) jsou senzitivizované antigeny Nicholsova znaku na Treponema pallidum. V případě, že je sérum pozitivní na syfilis se červené krvinky agregují do charakteristického tvaru na povrchu mikrotitračních jamek. Protilátky proti ostatním nepatogenním treponemam jsou absorbovány při extrakci Reiterových treponem přítomných v buněčné suspenzi, což významně snižuje falešně pozitivní reakci. Jiné nespecifické reakce lze detekovat a eliminovat pomocí nesenzitivizovaných kontrolních buněk. Všechny vzorky se ředí 1:20. Do sousedních jamek mikrotitrační destičky se odměří kontrola a ředěný vzorek. Do jedné jamky se nesenzitivizovaná suspenze a do druhé jamky senzitivizovaná suspenze. Obsah jamek se jemně promíchá, destička se zakryje a reakce se nechá probíhat za laboratorní teploty 45 – 60 min (možno nechat i přes noc). Hemaglutinace se hodnotí 4+, 3+, 2+, 1+ (reaktivní), +/- (nejasná – opakovat test) nebo jako negativní (nereaktivní). Negativní kontrola vykazuje negativní reakci (bez aglutinace) jak s ptačími buňkami senzitivizovanými Nicholsovým antigenem Treponema pallidum tak s nesenzitivizovanou suspenzí stabilizovaných ptačích buněk. Pozitivní kontrola vykazuje aglutinaci s ptačími buňkami senzitivizovanými Nicholsovým antigenem Treponema pallidum, ale nikoliv s nesenzitivizovanou suspenzí stabilizovaných ptačích buněk. Pozitivní kontrola má titr 1:2560. Séra, která vykazují aglutinaci s nesenzitivizovanou suspenzí stabilizovaných ptačích buněk ukazují na přítomnost nespecifických aglutininů a musí být testována znovu po absorpci (100 µl séra se dobře promíchá s 400 µl nesenzitivizované suspenze stabilizovaných ptačích buněk, po 1 h stání se provede centrifugace a supernatant se naředí 1:4 a znovu analyzuje). Test potvrzuje infekci prokázanou jinými metodami.

Mikroskopie v zástinu: tato metoda dosud zůstává jednou z nejjednodušších a nejspolehlivějších pro přímou detekci Treponema pallidum. Vyšetřují se exudáty a tekutiny z ranek mikroskopii v zástinu. Identifikace baktérie je založena na charakteristické morfologii a pohyblivosti spirochéty. Tato metoda je vhodná, když je ranka vlhká a mikroskopie může být provedena ihned po odběru vzorku. Při detekci je třeba zkušenosti. Antibiotika mohou zapříčinit falešně negativní nález. Metoda má omezenou citlivost.   

Přímý fluorescenční test absorbance protilátky (FTA-ABS) je schopen detekovat syfilis od 4. týdne po expozici. Je snadnější na provedení, než mikroskopie v zástinu. Detekuje antigen a nevyžaduje tedy přítomnost pohyblivých treponem. Je specifičtější, pokud se objeví ranky. Test používá fluorescein izotiokyanát (FITC) jako značku při vyšetřování vzorků ústních nebo rektálních stěrů. Nicméně nerozliší Treponema pallidum a ostatní treponemy. Antigenem je celá bakterie, kterou nelze kultivovat na laboratorních médiích, a proto se používá extrakt z králičích varlat. Aby se zvýšila specifita, smíchá se pacientské sérum s absorbentem, což je extrakt nepatogenní Treponema phagedenis biotypu Rieter. Tím se odstraní protilátky vůči treponemam, které nejsou specifické vůči bakteriím syfilis. Takto upravené sérum se dá na sklíčko, a jestliže je přítomna bakterie syfilis, tak se její protilátky váží na FITC a přidávají se další protilátky, kdy je na lidský imunoglobulin vázaný tetrametylrodamin izotiokyanát (TRITC). Poloha spirochéty je určena vybarvením FITC a barvení TRITC identifikuje, zda má pacient protilátky vůči Treponema pallidum na stejné spirochétě.

ELISA sendvičová využívá rekombinantní proteiny TpN15, TpN17 a TpN47, jak značené tak neznačené, nesoucí imunodominantní epitopy Treponema pallidum. Povrch jamek mikrotitračních destiček je potažený neznačenými antigeny spolu s protilátkami vůči lidskému IgG a IgM. Vzorky séra či plazmy se inkubují v jamkách 30 min při 37 °C a jsou-li přítomny specifické protilátky proti T. pallidum, dojde k jejich zachycení příslušnými antigeny na destičce. Kromě toho dojde též k zachycení určité části celkových protilátek třídy IgG a IgM přítomných ve vzorku prostřednictvím protilátek vůči lidským imunoglobulinům. Vzorek, včetně všech nenavázaných protilátek, se poté 5x vymyje. Při dalším kroku se přidá konjugát (rekombinantní proteiny T. pallidum značené křenovou peroxidázou), který je zachycen specifickými protilátkami již navázanými na povrchu jamek (inkubace 60 min při 37 °C). Nenavázaný konjugát se vymyje 5x a do jamek se přidá roztok obsahující tetrametylbenzidin a peroxid vodíku. V jamkách s navázaným konjugátem vznikne purpurové zbarvení (inkubace 30 min při 37 °C ve tmě), které se zastavením reakce 0,5 M kyselinou sírovou změní na oranžové. Absorbance je přímo úměrná množství antigenu a měří se do 15 min při 450/620-690 nm. Cutoff hodnota má absorbanci vyšší než negativní kontrola o 0,2. Výsledky < cutoff jsou nereaktivní, výsledky > cutoff jsou reaktivní. Preciznost v sérii je 4,4 – 6,3 %, mezi sériemi 6,4 – 13,0 %. Diagnostická senzitivita je 99,1 %, diagnostická specifita je 99,2 %.

ELISA kompetitivní: Specifické protilátky proti T. pallidum (IgG a/nebo IgM) obsažené ve vzorku a protilátky vůči Treponema pallidum značené POD soutěží o vazbu na antigeny T. pallidum, kterými jsou potaženy jamky na mikrotitrační destičce (inkubace 90 min při 37 °C). Po promytí 3x se do jamek se přidá roztok obsahující tetrametylbenzidin a peroxid vodíku. S křenovou peroxidázou vznikne purpurové zbarvení (inkubace 30 min při 37 °C ve tmě), které se zastavením reakce 0,25 M kyselinou sírovou změní na oranžové. Absorbance je nepřímo úměrná množství antigenu a měří se do 60 min při 450/615-690 nm. Preciznost v sérii 6,5 – 7,38 %, mezi sériemi 4,5 -22,7 %. Diagnostická citlivost je 97,3 %, diagnostická specifita 99,5 %.

ELISA IgG: Mikrotitrační jamky jsou potažené Nicholsovými antigeny T. pallidum, na které se během inkubace (60 min, 37 °C) naváží specifické protilátky ze séra. Po promytí 5x se přidají myší monoklonální IgG protilátky konjugované s křenovou peroxidázou (60 min, 37 °C). Po promytí 5x se přidá tetrametylbenzidin a enzymová reakce se zastaví po 30 min (ve tmě) 0,5 M H₂SO₄. Absorbance měřená do 30 min při 450 nm je přímo úměrná koncentraci IgG protilátek vůči T. pallidum. Preciznost v sérii je 3 – 8 %, mezi sériemi 4,7 – 12,8 %. Relativní citlivost je 98,4 %, relativní specifita 99,3 %.

ELISA IgM: Před imunoreakcí se provede úprava ředěného vzorku, tj. inkubace s IgG-RF sorbentem (15 min, laboratorní teplota), který obsahuje hyperimunní protilátky vůči lidskému IgG a tak se vyloučí kompetitivní inhibice specifického IgG a odstraní revmatoidní faktory. Tato úprava zabrání falešně negativním nebo falešně pozitivním výsledkům.

Mikrotitrační jamky jsou potažené antigeny T. pallidum, na které se během inkubace (60 min, 37 °C) naváží specifické protilátky ze séra. Po promytí 5x se přidají lidské IgM protilátky konjugované s křenovou peroxidázou (30 min, laboratorní teplota). Po promytí 5x se přidá tetrametylbenzidin a enzymová reakce se zastaví po 15 min (ve tmě) 0,2 M H₂SO₄. Absorbance měřená do 30 min při 450/620 nm je přímo úměrná koncentraci IgM protilátek vůči T. pallidum. Diagnostická citlivost je 95 %, diagnostická specifita 95 %.

Chemiluminiscenční analýza v sendvičovém uspořádání používá rekombinantní antigeny TP (TpN15, TpN17 a TpN47) zakotvené na paramagnetických částicích, ke kterým se přidává ředěný standard nebo vzorek. Protilátky vůči Treponema pallidum, přítomné ve vzorku se naváží na antigeny TP na mikročásticích. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá konjugát myších protilátek vůči lidskému IgG a IgM značený akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je přímo úměrná hladině protilátek vůči Treponema pallidum a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Metoda dovoluje měřit vzorky na základě jednobodové kalibrace v tripletu a cutoff je 0,2 x průměr této hodnoty. Výsledky < cutoff jsou pro nereaktivní vzorky, výsledky ≥ cutoff jsou pro reaktivní vzorky. Preciznost v sérii je 2,0 – 8,1 %, mezi sériemi 4,0 – 12,4 %. Relativní senzitivita je 99,8 %, relativní specifita 99,3 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu (5 g/l), bilirubinu (342 µmol/l) a triacylglycerolů (33,9 mmol/l) neruší.

Podobný princip zábleskové luminiscence lze použít s esterem akridinu jako značkou. Ke vzorku ředěného pacientského séra se přidají rekombinantní antigeny Tp15 a Tp17, značené esterem akridinu. Po inkubaci 5,7 min při 37 °C se přidají biotinylované rekombinantní antigeny Tp15 a Tp17 a paramagnetické částice latexové částice s kovalentně vázaným streptavidinem ve fosfátovém pufru hovězího sérového albuminu. Po inkubaci 15 min při 37 °C následuje odsátí roztoku a promytí zkumavek. Pak se přidá peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk fotonásobičem při 429 nm na základě dvoubodové kalibrace a přístroj vypočítá cutoff. Vzorky < 0,9 cutoff jsou nereaktivní, ≥ 0,9 až < 1,1 cutoff jsou neurčité a ≥ 1,1 cutoff jsou reaktivní na protilátky vůči Treponema pallidum. Preciznost v sérii 1,2 – 1,9 %, mezi sériemi 2,4 – 3,3 %. Relativní senzitivita je 96,7 %, relativní specifita 99,1 %.  Ani vysoké koncentrace hemoglobinu (5 g/l), bilirubinu (684 µmol/l) a triacylglycerolů (11,3 mmol/l) neruší.

Jiné stanovení je založeno na sendvičové imunochemické reakci se sledováním luminiscence zesílené enzymem. Rekombinantní purifikovaný antigen Tp17 konjugovaný s alkalickou fosfatázou se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váže na protilátku vůči Treponema pallidum ze vzorku a na druhé vazebné místo této protilátky se naváže rekombinantní purifikovaný antigen Tp17 imobilizovaný na polystyrénové kuličce. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření 425 – 500 nm je přímo úměrná hladině Treponema pallidum ve vyšetřovaném vzorku. Hodnoty cutoff jsou stanoveny z průměru dubletu kalibrátoru. Vzorky < 0,9 cutoff jsou nereaktivní, ≥ 0,9 až < 1,1 cutoff jsou neurčité a ≥ 1,1 cutoff jsou reaktivní na protilátky vůči Treponema pallidum.  Preciznost v sérii 4,4 – 7,6 %, celkem 4,4 – 7,7 %. Relativní senzitivita je 97,9 %, relativní specifita 98,0 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu (5,9 g/l), bilirubinu (342 µmol/l) a triacylglycerolů (33,9 mmol/l) neruší. Heterofilní protilátky mohou reagovat s imunoglobuliny v komponentech soupravy a způsobit interference.

Chemiluminiscenční analýza protilátek vůči T. pallidum v dvojstupňovém sendvičovém provedení probíhá tak, že se v prvním kroku váží na TP biotinylované antigeny, kterým jsou potaženy jamky mikrotitrační destičky (přes streptavidin-biotinový můstek). Po inkubaci (16 min, 37 °C) se přidá konjugát TP antigenů značených křenovou peroxidázou. Po inkubaci (8 min, 37 °C) se promytím odstraní volný materiál a přidá se luminogen (derivát luminolu + sůl peroxykyseliny) jehož oxidaci katalyzuje POD za vzniku světla. Celkově trvá analýza 35 min. Činidlo pro přenos elektronů (substituovaný acetanilid) zvyšuje hladinu uvolněného světla a prodlužuje jeho emisi. Signál je přímo úměrný koncentraci protilátek vůči T. pallidum ve vzorku. Kalibrační křivka se adjustuje ze vzorové křivky po analýze kalibrátoru. Vzorky < 0,8 cutoff jsou nereaktivní, ≥ 0,8 až < 1,2 cutoff jsou neurčité a ≥ 1,2 cutoff jsou reaktivní na protilátky vůči Treponema pallidum. Preciznost v sérii 0,9 – 3,2 %, mezi sériemi je 2,1 – 9,0 %. Relativní senzitivita je 98,6 %, relativní specificita 99,9 %. Vysoké koncentrace hemoglobinu (10 g/l), bilirubinu (342 µmol/l) a triacylglycerolů (33,9 mmol/l) neruší při analýze. Nelze použít zakalené vzorky. Heterofilní protilátky mohou ovlivňovat výsledky analýzy. Hladiny biotinu jsou zvýšené 24 h po podání.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (10 µl) je inkubován s biotinylovanými TP specifickými rekombinantními antigeny a TP specifickými rekombinantními antigeny značenými ruthéniovým komplexem. Pak se přidají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem, na který se naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou stanoveny na základě hodnoty cutoff, která je určena na základě dvoubodové kalibrace. Vzorky < 1,0 cutoff jsou nereaktivní a ≥ 1,0 cutoff jsou reaktivní na protilátky vůči Treponema pallidum. Preciznost v sérii 1,5 – 2,8 %, mezi sériemi 1,9 – 5,0 %. Relativní senzitivita je 99,6 %, relativní specificita 99,7 %. Hemolýza (hemoglobin 5 g/l), chylozita (TAG 22,6 mmol/l), ikterus (bilirubin 1129 µmol/l) a RF (< 1500 kU/l) neruší. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměli odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován. Reagencie nutno skladovat při 2 – 8 °C. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu (29 g/l), bilirubinu (1026 µmol/l) a triacylglycerolů (30,5 mmol/l) neruší.  Ve vzácných případech je možné pozorovat interferenci způsobenou velmi vysokým titrem protilátek vůči streptavidinu nebo rutheniu.

Western blot: používá lyzát celých buněk a rekombinantní antigeny. Reaktivita antigenů na treponemových antigenních pásech je vysoce specifická pro syfilis. WB je velmi užitečný doplňkový konfirmační test pro IgG nebo IgM protilátky vůči Treponema pallidum. Provedla se elektroforéza na polyakrylamidovém gelu s laurylsíranem sodným ultrazvukem deaktivovaných bakterií TP při 100 V. Průběh elektroforézy byl sledován pomocí nízkomolekulárních vybarvených markerů. Rozdělené bílkoviny byly přeneseny na nitrocelulózový papír pomocí přenosového blot systému při 100 V během 45 min. Po přenosu byla membrána blokována 5 % odstředěným práškovým mlékem ve fosfátovém pufru po dobu 60 min. Pak byla promyta 3x fosfátovým pufrem a rozřezána na proužky 5x75 mm. Proužky byly ihned použity, nebo skladovány při -20 °C. Všechny další kroky byly prováděné za laboratorní teploty a třepání. Proužky pro imunoblot byly umístěny do jednotlivých korýtek blotovacího tácu a inkubovány přes noc se séry ředěnými 1+100 fosfátovým pufrem (+Tween 20). Proužky se promyly 3x po 5 min fosfátovým pufrem a pak byly inkubovány 120 min s konjugátem křenové peroxidázy a ovčí protilátky vůči lidskému IgG (ředění 1+800) nebo lidskému IgM (ředění 1+200). Pak byly promyty 3x po 5 min fosfátovým pufrem a vybarvovány 15 min 4-chlor-1-naftol peroxidázovým substrátem. Reaktivní séra poskytly viditelné pásy, odpovídající antigenům TpN47, Tp 44.5, TpN17, TpN15.

Mezinárodní standard: WHO International Standard 1st IS for human syphilitic plasma IgG NIBSC code: 05/122, Version 5.0, 23/01/2014.

Falešná negativita (rychlý reaginový test): zpracování vzorků při nižší teplotě.

Falešná pozitivita je (hemaglutinační test): v přítomnosti heteroaglutinačních protilátek, protilátek typu Forsmanové, kontaminace vzorku slinami, přítomnost protilátek vůči jiným treponemám; (VDRL netreponemový test): mycoplasma pneumonie, malárie, lepra, akutní bakteriální infekce, infekční mononukleóza, autoimunitní choroby, kolagenózy, těhotenství, chylozita vzorků, excesivní hemolýza, po požití alkoholu; (rychlý reaginový test): u zvýšené koncentrace reaginů, biologická falešná pozitivita, systémový lupus erythematodes, malárie, spalničky, infekční mononukleóza, lepra, febris reccurens, typhus abdominalis, virová pneumonie.