Parotitis antibodies, mumps antibodies

Průkaz se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans citrát). Stabilita v séru je 5 d při 2 – 8 °C, při delším skladování se doporučuje zamrazení na -20 až -80 °C. Opakované rozmrazování vzorku se nedoporučuje.

Komplement fixační reakce V reakci je pět složek: antigen (Parotitis virus), vyšetřované sérum pacienta, komplement, beraní krvinky, králičí sérum s protilátkami proti beraním krvinkám (tzv. amboceptor). Princip reakce lze popsat ve 4 krocích: smísí se zkoumané sérum (ředěné 1:2 až 1:48), v němž byl inaktivován vlastní komplement a příslušný antigen (pozitivita: vzniknou komplexy antigen-protilátka, negativita: komplexy antigen-protilátka nevzniknou); přidá se morčecí komplement alexin – inkubace 1 h 37 °C (pozitivita: komplement se vyváže na komplexy antigen-protilátka, negativita: komplement se nevyváže a je nadále aktivní); mimo reakci se připraví tzv. hemolytický systém, tj. ovčí krvinky s navázanými protilátkami proti těmto (zdrojem protilátek je obvykle králičí antisérum proti ovčím krvinkám); do reakce se přidá hemolytický systém – inkubace 60 min při 37 °C (pozitivita: komplement je vyvázán, tedy neaktivní a nedojde k hemolýze, negativita: komplement se vyváže na hemolytický systém tj. vlastně komplexy antigen-protilátka a dojde k hemolýze). Komplement fixační reakce se hodnotí v několika ředěních séra. Jako výsledek se udává nejvyšší ředění séra (titr), při kterém ještě nedošlo k hemolýze. Reakce je citlivá, ale nelze rozlišit jednotlivé třídy protilátek. Reakce je pozitivní jak na IgG tak na IgM protilátky při titru 1:32 nebo vyšším.

Neutralizační test – sérum se smíchá s kulturou konkrétního viru a nechá se inkubovat. Obsahuje-li testované sérum protilátky proti tomuto viru, dojde k vazbě protilátek na receptory viru a jeho inaktivaci. Neobsahuje-li sérum protilátky, virus zůstane aktivní. Inkubovaným roztokem se poté naočkuje buněčná kultura. V pozitivním případě (sérum obsahuje protilátky proti viru) inaktivovaný virus není schopen napadnout buňky a nedojde k vytvoření cytopatického efektu. Je-li sérum negativní, na buněčné kultuře je pod mikroskopem patrný cytopatický efekt. Metoda se obvykle provádí v několika ředěních séra (dvojkovou řadou). Vhodně naředěné sérum se pipetuje do jamek mikrotitračních destiček a inkubuje 30 min za laboratorní teploty s virem příušnic v Eagleově médiu (obsahuje aminokyseliny, soli, glukózu a vitaminy). Pak se zabalí do filmu a inkubuje 5 dní při 37 °C ve vlhku a v atmosféře 5 % CO₂. Přidá se suspenze morčecích erytrocytů ve fosfátovém pufru a nechá se adsorbovat 15 min při 4 °C. Pak se promyje fosfátovým pufrem a v místech replikace viru je viditelná hemadsorpce. Při odečítání hemadsorpce může být dosaženo zvýšení citlivosti přidáním směsi 4 % roztoku o-tolidinu v kyselině octové a 10 % H₂O₂ ve fosfátovém pufru. Po 1 – 2 min za laboratorní teploty se vyvine tmavě zelené zbarvení v jamkách obsahujících erytrocyty. Protože o-tolidin je kancerogenní, lze jej nahradit jinými redox indikátory, např. guajakolem nebo tetrametylbenzidinem.

Hemaglutinační inhibice Principem reakce je inhibice hemaglutinačních účinků antigenu, tj. viru příušnic. Nutnou podmínkou jsou tedy hemaglutinační schopnosti antigenu. Při provedení reakce se nejprve v mikrotitrační destičce vzorek séra (ředěného dvojkovou řadou) či plazmy smísí s antigenem viru příušnic a po inkubaci (1 h, 37 °C). Pak se přidá fosfátový pufr nebo protilátka vůči imunoglobulinům (zvýšení citlivosti) a inkubuje se 30 min za laboratorní teploty. Jsou-li přidány imunoglobuliny, destička se centrifuguje. Dále se přidají taninované hovězí erytrocyty. Destička se inkubuje při 37 °C 1 h; je-li v séru dostatečná koncentrace specifických protilátek, tyto se naváží na antigen, a inhibují jeho hemaglutinační schopnosti. Většinou se reakce hodnotí pouze kvalitativně a provádí se v několika ředěních séra. Jako výsledek se udává nejvyšší ředění séra (1:10 až 1:2560) dvojkovou řadou (tzv. titr) při kterém ještě nedošlo k hemaglutinaci. Je-li titr < 1:20 je reakce považována za negativní. Popsaná reakce je tzv. přímou reakcí inhibice hemaglutinace. Při testu se nerozlišují protilátky IgG a IgM.

Jednoduchá radiální hemolýza (hemolýza v gelu – HIG) vyžaduje přípravu erytrocytů (obvykle ovčí, ale mohou se použít i kuřecí). Erytrocyty se propláchnou 3 – 6x fosfátovým pufrem a inkubují se 30 min při 4 °C s virem příušnic; centrifugují se a resuspendují ve fosfátovém pufru ohřátém na 45 °C. Dále se intenzivně promíchají s agarózou a nalijí na Petriho misku. Po ztuhnutí se v gelu vytlačí 3 mm díry a naplní sérem, které se nechá difundovat 24 h při 4 °C. Každá miska se polije ředěným morčecím sérem v barbitalovém pufru (pH 7,2) a inkubuje se 2 h při 37 °C. Měří se zóna hemolýzy. Nespecifická lýza se kontroluje paralelní reakcí s erytrocyty nepotaženými virem.    

Nepřímá imunofluorescence IgG Do jamek destiček s ukotveným antigenem příušnic byla pipetována analyzovaná séra (naředěná fosfátovým pufrem). Po inkubaci 30 min při 20 – 25 °C vypláchnutí a promývání (2x) byl přidán konjugát fluorescein izotiokyanátu s protilátkou vůči lidskému IgG. Následovala další inkubace 30 min při 20 – 25 °C. Pak byly vzorky promyty (2x), vysušeny a překryty glycerolovým médiem s fosfátovým pufrem a analyzovány ve fluorescenčním mikroskopu. Vzorky bez fluorescence jsou negativní, s titrem 1:10 nepřímé fluorescence (excitace 488 nm, emise 530 nm) na 1+ jsou nejasné a s titrem 1:10 a fluorescencí > 1 jsou pozitivní (titr 1:100 je akutní infekce). Senzitivita: 100 %, specificita: 100 %. Hemolytické, lipemické a ikterické vzorky nevykazují žádné interference do koncentrací 5 g Hb/l, 22,6 mmol/l TAG a 684 µmol/l bilirubinu.

Nepřímá imunofluorescence IgM Pro průkaz IgM protilátek je třeba sérum upravit reakcí se sorbentem (kozí protilátkou vůči lidskému IgG). Do jamek destiček s ukotveným antigenem příušnic byla pipetována analyzovaná séra (naředěná fosfátovým pufrem). Po inkubaci 30 min při 20 – 25 °C vypláchnutí a promývání (2x) byl přidán konjugát fluorescein izotiokyanátu s protilátkou vůči lidskému IgM. Následovala další inkubace 30 min při 20 – 25 °C. Pak byly vzorky promyty (2x), vysušeny a překryty glycerolovým médiem s fosfátovým pufrem a analyzovány ve fluorescenčním mikroskopu. Vzorky bez fluorescence jsou negativní, s titrem 1:10 nepřímé fluorescence (excitace 488 nm, emise 530 nm) na 1+ jsou nejasné a s titrem 1:10 a fluorescencí > 1 jsou pozitivní (titr 1:100 je akutní infekce). Senzitivita: 100 %, specificita: 100 %. Hemolytické, lipemické a ikterické vzorky nevykazují žádné interference do koncentrací 5 g Hb/l, 22,6 mmol/l TAG a 684 µmol/l bilirubinu.

ELISA IgG umožňuje in vitro semikvantitativní vyšetření na protilátky třídy IgG vůči antigenům příušnic v séru nebo plazmě. Reakční jamky mikrotitračních destiček jsou potažené antigenem viru příušnic. V prvním kroku reakce jsou zředěné vzorky sér inkubovány v jamkách 60 min při 37 °C. V případě pozitivního vzorku se specifické IgG protilátky (také IgM) váží k antigenům. Po promytí pufrem (3x) se k detekci navázaných protilátek provádí následně inkubace 30 min za laboratorní teploty ve tmě s enzymovým konjugátem (protilátka vůči lidskému IgG značená peroxidázou), který je schopen vyvolat barevnou reakci, následně po promytí pufrem (3x), s přidaným tetrametylbenzidinem a H₂O₂. Po 15 min ve tmě se reakce zastaví 0,2 M H₂SO₄ a intenzita vzniklého zabarvení je přímo úměrná koncentraci IgG protilátek proti antigenům virů příušnic. Měření se provádí při 450/620 nm do 30 min. Vysoce pozitivní vzorky mohou tvořit precipitát, proto se ředí fosfátovým pufrem a celý postup se u nich opakuje. Semikvantitativní výsledky jsou hodnoceny v poměru k absorbanci cutoff kalibrátoru tak, že výsledky < 0,9 jsou negativní; 0,9 až 1,1 jsou hraniční a > 1,1 jsou pozitivní. Přesnost v sérii 5,4 %, mezi sériemi 2,9 %. Senzitivita: > 95 %, specifita: 87,5 %. Hemolytické, lipemické a ikterické vzorky nevykazují žádné interference do koncentrací 10 g Hb/l, 5,6 mmol/l TAG a 342 µmol/l bilirubinu.

ELISA IgM umožňuje in vitro semikvantitativní vyšetření na protilátky třídy IgM vůči antigenům příušnic v séru nebo plazmě. Reakční jamky mikrotitračních destiček jsou potažené antigenem viru příušnic. V prvním kroku reakce jsou zředěné vzorky sér inkubovány v jamkách 60 min při 37 °C. V případě pozitivního vzorku se specifické IgM protilátky (také IgG) váží k antigenům. Po promytí pufrem (3x) se k detekci navázaných protilátek provádí následně inkubace 30 min za laboratorní teploty ve tmě s enzymovým konjugátem (protilátka vůči lidskému IgM značená peroxidázou), který je schopen vyvolat barevnou reakci, následně po promytí pufrem (3x), s přidaným tetrametylbenzidinem a H₂O₂. Po 15 min ve tmě se reakce zastaví 0,2 M H₂SO₄ a intenzita vzniklého zabarvení je přímo úměrná koncentraci IgG protilátek proti antigenům virů příušnic. Měření se provádí při 450/620 nm do 30 min. Vysoce pozitivní vzorky mohou tvořit precipitát, proto se ředí fosfátovým pufrem a celý postup se u nich opakuje. Semikvantitativní výsledky jsou hodnoceny v poměru k absorbanci cutoff kalibrátoru tak, že výsledky < 0,9 jsou negativní; 0,9 až 1,1 jsou hraniční a > 1,1 jsou pozitivní. Přesnost v sérii 4,6 %, mezi sériemi 5,5 %. Senzitivita: > 95 %, specifita: > 95 %. Hemolytické, lipemické a ikterické vzorky nevykazují žádné interference do koncentrací 10 g Hb/l, 5,6 mmol/l TAG a 342 µmol/l bilirubinu.

Některé testy, které detekují IgG mohou reagovat s jinými protilátkami vůči paramyxovirům.