Hepatitis B envelope Antibody, Hepatitis Be Virus Antibody, Hepatitis Be Antibody, Hepatitis Be Ab, Hep Be Ab, Anti-HBE, HBeAb, HbeAB

Stanovení se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans: heparin, EDTA, citrát). Stabilita v séru při laboratorní teplotě i při 4 – 8 °C 7 d, při -20 °C dlouhodobě.

Všechny soupravy jsou určeny pro kvalitativní stanovení.

ELISA Při průkazu blokují anti-HBe ve vyšetřovaném vzorku HBeAg nacházející se v pipetované reagencii. U anti-HBe pozitivních vzorků přítomnost HBeAg buď nelze prokázat vůbec, nebo jen v minimálním množství. Barevná intenzita vzorku je nepřímo úměrná koncentraci přítomných anti-HBe. Do jamek mikrotitračních destiček s navázanou monoklonální myší anti-HBe se pipetují standardy nebo vzorky (mohou obsahovat další anti-HBe) a přidá se HBeAg. Inkubace 60 min při 37 °C. Po promytí 2x se přidá konjugát monoklonální myší anti-HBe s POD a inkubuje se 60 min při 37 °C. Po promytí 4x se přidá chromogen. Enzymová část konjugátu zbarví roztok tetrametylbenzidinu s H₂O₂ modře (18 – 25 °C, 30 min ve tmě). Tato reakce je zastavena přidáním zastavovacího roztoku (1 M H₂SO₄), který způsobí barevnou změnu na žlutou barvu. Na základě kompetitivního principu testu je intenzita zbarvení (450/615-690 nm) nepřímo úměrná koncentraci protilátek vůči HBe přítomných ve vzorku. Měření se provádí do 1 h. Absorbance průměru negativních kontrol násobená 0,5 je cut-off. Negativní výsledky > cutoff + 10 %, hraniční cutoff – 10 % až cutoff + 10 %, pozitivní < cutoff – 10 %. Preciznost v sérii je 3,2 – 7,4 %, mezi sériemi 3,4 – 6,3 %. Relativní senzitivita je 97,8 %, relativní specificita 99,6 %. Hemolytické vzorky mohou způsobit falešně vysokou reaktivitu. Vzorky pacientů po hemodialýze mohou vykazovat zvýšenou reaktivitu.

Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) v kompetitivním uspořádání probíhá tak, že se do reakční nádobky dávkuje vzorek ředěný TRIS pufrem a poté rekombinantní HBeAg. Dále se přidají latexové mikročástice potažené myší monoklonální protilátkou vůči HBe. Po inkubaci se reakční směs přenese na fritu. Přidá se konjugát myších monoklonálních protilátek vůči HBe značený ALP v pufru TRIS, který obsadí jiný epitop HBeAg. Po inkubaci a promytí se dávkuje substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí na fluoreskující umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky. Fluorescence je nepřímo úměrná anti-HBe. K jednobodové kalibraci (v dubletu) slouží indexový kalibrátor. Cut-off odpovídá 2,5 násobku průměrné reakční rychlosti kalibrátoru (nižší hodnoty než cut-off mají reaktivní vzorky, naopak vyšší než cut-off mají nereaktivní vzorky). Preciznost v sérii je 3,5 – 13,9 %, mezi sériemi 4,7 – 13,2 %. Relativní senzitivita je 98,1 %, relativní specificita 99,1 %. Vzorky pacientů, kterým byly aplikovány myší protilátky, mohou vykazovat falešné hodnoty.

Chemiluminiscenční analýza v kompetitivním uspořádání používá rekombinantní obálkový antigen viru hepatitidy B, o jehož vazebná místa soutěží anti-HBe ze vzorku s myší monoklonální protilátkou vůči HBeAg zakotvenou na paramagnetických částicích. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá myší protilátka vůči HBeAg značená akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je nepřímo úměrná hladině anti-HBe a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Jednobodová kalibrace (v tripletu) slouží k určení cutoff (průměrná hodnota kalibrátoru x 0,5). Vzorky, které mají index cut-off  (signál vzorku / průměrný signál kalibrátoru) ≤ 1,00 jsou reaktivní na anti-HBe, > 1,00 jsou nereaktivní. Preciznost v sérii je 3,7 – 5,6 %, mezi sériemi 4,5 – 6,6 %. Relativní senzitivita je 99,5 %, relativní specificita 99,0 %. Silná hemolýza ruší. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

Podobný princip zábleskové luminiscence v kompetitivním uspořádání lze použít s esterem akridinu jako značkou. Ke vzorku se pipetuje rekombinantní HBeAg. Po inkubaci 29 min při 37 °C se přidají paramagnetické latexové částice potažené streptavidinem, biotinylovaná monoklonální myší anti-HBe a monoklonální myší protilátka vůči HBe značená esterem akridinu. Při další inkubaci (18 min při 37 °C) se na částice připojí imunokomplex. Po odsátí roztoku a promytí zkumavek se přidá peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk (intenzita signálu je nepřímo úměrná množství anti-HBe) fotonásobičem při 429 nm. K určení cut-off se provádí dvoubodová kalibrace (v dubletu). Vzorky s koncentrací anti-HBe < 0,8 indexu se považují za nereaktivní, 0,8 – 1,2 jsou neurčité a ≥ 1,2 indexu jsou reaktivní (Pozor pro výpočet indexu je cut-off neobvykle v čitateli!). Preciznost v sérii je 2,3 – 2,8 %, mezi sériemi 4,2 – 4,7 %. Relativní senzitivita je 98,3 %, relativní specificita 95,1 %. Koncentrace hemoglobinu 5 g/l, triacylglycerolů 5,65 mmol/l a bilirubinu 684 µmol/l interferují < 10 %. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

CLIA je další kompetitivní dvojstupňový zábleskový postup, kdy anti-HBe ze vzorku se naváže během první inkubace (10 min) na rekombinantní obálkový antigen hepatitidy B. Pak se přidají magnetické částice potažené monoklonální myší protilátkou vůči HBeAg značenou izoluminolem a proběhne další inkubace (10 min), kdy se obsadí zbývající volné epitopy antigenu HBeAg. Po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je nepřímo úměrná hladině anti-HBe. Dva kalibrátory upravují vzorovou kalibrační křivku. Vzorky, které mají index cut-off  (signál vzorku / cut-off) ≥ 1,1 jsou nereaktivní na anti-HBe, < 0,9 jsou reaktivní a 0,9 – 1,1 jsou reaktivní v šedé zóně. Preciznost v sérii 1,6 – 6,4 %, mezi sériemi 5,7 – 20,4 %. Relativní senzitivita je 98,1 %, relativní specificita 98,8 %. Ani koncentrace hemoglobinu 10 g/l, triacylglycerolů 5,65 mmol/l a bilirubinu 85,5 µmol/l neruší.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v sekvenčním uspořádání trvá 18 min. Vzorek (35 µl) je inkubován s  rekombinantním HBeAg. Pak se přidá biotinylovaná myší monoklonální protilátka vůči HBeAg značená ruthéniovým komplexem a paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem, na které se naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Po inkubaci se reakční směs nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Cutoff je stanoveno na základě dvoubodové kalibrace. Luminiscence je nepřímo úměrná hladině anti-HBe ve vzorku. Výsledky s indexem > 1,0 jsou nereaktivní na anti-HBe, ≤ 1,0 jsou reaktivní na anti-HBe. Preciznost v sérii 2,0 – 4,1 %, mezi sériemi 2,0 – 6,6 %. Detekční limit 0,2 kU/l PEI (Paul Ehrlich Institut). Relativní specificita je 99,9 %. Hemolýza (hemoglobin 20 g/l), chylozita (triacylglyceroly 17 mmol/l), ikterus (bilirubin 85,5 µmol/l) a RF (< 2400 kIU/l) neruší. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměli odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Vzácně mohou interferovat protilátky vůči streptavidinu nebo rutheniu.

V dostupné literatuře nejsou uvedeny.