australský antigen; Australia Antigen, Australian Antigen, Hepatitis B Surface Ag, HbsAG, HAA

Stanovení se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans: heparin, EDTA, citrát). Stabilita při 20 – 25 °C 1 d, při 4 – 8 °C 7 d, při -20 °C 3 měsíce.

ELISA je dvoustupňový test založený na sendvičovém principu. Do jamek mikrotitračních destiček s navázanou ovčí polyklonální anti-HBs se pipetují standardy (pozitivní kontroly se dávkují jako poslední) nebo vzorky, biotinylovaná monoklonální myší anti-HBs a inkubuje se 60 min při 37 °C. Ve druhém kroku se po promytí 4x přidá konjugát streptavidinu s POD a inkubuje se 30 min při 37 °C. (Jiný postup je dvojstupňový. První reakce – 60 min – je použití zakotvené myší monoklonální protilátky vůči epitopu a  HBsAg s napipetovaným vzorkem a ve druhé reakci se přidá konjugát kozích protilátek vůči HBsAg s POD a inkubuje 30 min).Po promytí 4x se přidá chromogen. Enzymová část konjugátu zbarví roztok tetrametylbenzidinu s H₂O₂ modře (15 – 25 °C, 30 min ve tmě). Tato reakce je zastavena přidáním zastavovacího roztoku (0,5 M H₂SO₄), který způsobí barevnou změnu na žlutou barvu. Intenzita zbarvení (450/615-690 nm) přímo úměrná koncentraci HBsAg ve vzorku. Měření se provádí do 1 h. Kvalitativní hodnocení: absorbance průměru negativních kontrol + 0,05 je cut-off. Negativní výsledky na HBsAg < cutoff, pozitivní ≥ cutoff. Preciznost v sérii je 2,7 – 16,9 %, mezi sériemi 2,3 – 39,8 %. Relativní specificita je 99,78 %. Lipemické, hemolytické (6 g/l hemoglobinu), ikterické vzorky (1023 µmol/l) a vzorky obsahující revmatoidní faktory neovlivní test.

Konfirmační test je založen na neutralizaci před testováním pomocí ELISA HBsAg. Analyzovaný vzorek se inkubuje s reagencií, která obsahuje lidské (nebo koňské) specifické protilátky proti HBsAg (anti-HBs). Kvůli potvrzení se stejný vzorek inkubuje v druhé testované směsi s reagencií, která neobsahuje ani HBsAg ani anti-HBs. V první směsi blokují specifické protilátky proti HBsAg všechny antigenní determinanty HBsAg přítomné ve vzorku. Antigen již nelze detekovat v následně provedeném testu ELISA HBsAg, což vede ke snížené reaktivitě takto ošetřeného vzorku. Naopak vzorek ve druhé směsi vykazuje nezměněnou pozitivní reakci. Vzorky se v obou reakčních směsích inkubují 60 min při 37 °C. Vzorky jsou na základě konfirmačního testu považovány za pozitivní, pokud jejich reaktivita v systému ELISA HBsAg v kombinaci s první směsí (přidání protilátek anti-HBs) povede ke snížení signálu o více než 50 % ve srovnání s referenčním stanovením pomocí druhé směsi. Koncentrace HBsAg vyšší než 5 kU/l může překročit inhibiční kapacitu první směsi, proto je nutné vzorky s hodnotami absorbance vyššími než 1,5 před neutralizací naředit. Ikterické, hemolytické, lipemické vzorky, vzorky obsahující revmatoidní faktory a vzorky od těhotných žen výsledek testu neovlivňují.

Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) v kompetitivním uspořádání probíhá tak, že se do reakční nádobky dávkuje vzorek, mikročástice potažené myší monoklonální IgM anti-HBs a biotinylovaná kozí IgG anti-HBs (případně se vytvoří sendvič kolem HBsAg ze vzorku). Po inkubaci se reakční směs přenese na fritu. Přidá se konjugát králičích anti-biotinových protilátek značený ALP v pufru TRIS. Po inkubaci a promytí se dávkuje substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí na fluoreskující umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky. Fluorescence je přímo úměrná koncentraci HBsAg. K jednobodové kalibraci (v dubletu) slouží indexový kalibrátor. Cut-off odpovídá dvojnásobku průměrné reakční rychlosti kalibrátoru (nižší hodnoty než cut-off mají nereaktivní vzorky, naopak ≥ cut-off mají reaktivní vzorky na HBsAg). Preciznost v sérii je 3,1 – 5,8 %, mezi sériemi 3,3 – 5,8 %. Relativní senzitivita je 100 %, relativní specificita 99,6 %. Koncentrace hemoglobinu 2,5 g/l, triacylglycerolů 11,3 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neinterferují.

Konfirmační test je založen na neutralizaci před testováním pomocí MEIA HBsAg. Analyzovaný vzorek se inkubuje s reagencií, která obsahuje lidské specifické protilátky proti HBsAg (anti-HBs). Kvůli potvrzení se stejný vzorek inkubuje v druhé testované směsi s reagencií, která neobsahuje ani HBsAg ani anti-HBs. Mimoto se s oběma reagenciemi testují 500x ředěné vzorky. V první směsi blokují specifické protilátky proti HBsAg všechny antigenní determinanty HBsAg přítomné ve vzorku. Antigen již nelze detekovat v následně provedeném testu MEIA HBsAg, což vede ke snížené reaktivitě takto ošetřeného vzorku. Naopak vzorek ve druhé směsi vykazuje nezměněnou pozitivní reakci. K jednobodové kalibraci (v dubletu) slouží indexový kalibrátor. Cut-off odpovídá průměrné reakční rychlosti kalibrátoru x 1,5. Vzorky jsou na základě konfirmačního testu považovány za pozitivní, pokud jejich reaktivita v systému MEIA HBsAg v kombinaci s první směsí (přidání protilátek anti-HBs) povede ke snížení signálu o více než 50 % ve srovnání s referenčním stanovením pomocí druhé směsi. Koncentrace hemoglobinu 2,5 g/l, triacylglycerolů 11,3 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neinterferují.

Chemiluminiscenční analýza v jednostupňovém uspořádání používá paramagnetické částice potažené myší monoklonální IgM anti-HBs se kterými se smíchá vzorek a anti-HBs (směs myší a kozí IgG) značená akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je přímo úměrná hladině HBsAg a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Cutoff je 0,0575 x průměrná hodnota kalibrátoru 1 + 0,8 x průměrná hodnota kalibrátoru 2. Je-li signál < cutoff je vzorek nereaktivní, je-li ≥ je vzorek reaktivní. Preciznost v sérii je 1,7 – 5,1 %, celkem 2,1 – 7,9 %. Relativní senzitivita je 99,7 %. Koncentrace hemoglobinu 5 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neinterferují. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

V případě kvantitativního stanovení se používá dvojstupňová metoda. V prvním kroku se přidá vzorek k paramagnetickým částicím potaženým myší monoklonální anti-HBs. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se ve druhém kroku dávkuje anti-HBs (kozí IgG) značená akridiniumkarboxamidem. Další postup je stejný jako u kvalitativního stanovení. Rozsah kvantitativního stanovení na základě dvoubodové kalibrace je 0 – 250 kU/l (manuální ředění 20x nebo 500x). Vzorky < 0,05 kU/l jsou nereaktivní na anti-HBs, ≥ 0,05 kU/l jsou reaktivní. Senzitivita metody je 0,05 kU/l.

Konfirmační test je založen na neutralizaci před testem. Analyzovaný vzorek se inkubuje s reagencií, která obsahuje lidské specifické protilátky proti HBsAg (anti-HBs). Kvůli potvrzení se stejný vzorek inkubuje v druhé testované směsi s reagencií, která neobsahuje ani HBsAg ani anti-HBs. V první směsi blokují specifické protilátky proti HBsAg všechny antigenní determinanty HBsAg přítomné ve vzorku. Antigen již nelze detekovat v následně provedeném testu na HBsAg, což vede ke snížené reaktivitě takto ošetřeného vzorku. Naopak vzorek ve druhé směsi vykazuje nezměněnou pozitivní reakci. Provede se kalibrace dvěma kalibrátory v tripletu jako u kvantitativního stanovení. Cut-off se vypočítá jako průměrná reakční rychlost kalibrátoru 1 + 0,075 (průměrná reakční rychlost kalibrátoru 2 – průměrná reakční rychlost kalibrátoru 1). Vzorky jsou na základě konfirmačního testu považovány za pozitivní, pokud jejich reaktivita v kombinaci s první směsí (přidání protilátek anti-HBs) povede ke snížení signálu o více než 50 % ve srovnání s referenčním stanovením pomocí druhé směsi.

Podobný princip zábleskové luminiscence v sendvičovém uspořádání lze použít s esterem akridinu jako značkou. Ke vzorku se pipetuje biotinylovaná myší monoklonální anti-HBs a myší monoklonální anti-HBs značená esterem akridinu. Po inkubaci 5 min při 37 °C se přidají paramagnetické latexové částice potažené streptavidinem. Při další inkubaci (18 min při 37 °C) se na částice připojí imunokomplex. Po odsátí roztoku a promytí zkumavek se přidá peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk (intenzita signálu je přímo úměrná množství HBsAg) fotonásobičem při 429 nm. K určení cut-off se provádí dvoubodová kalibrace. Vzorky s koncentrací HBsAg < cutoff se považují za nereaktivní, ≥ cutoff jsou reaktivní na HBsAg. Preciznost v sérii je 2,5 – 7,3 %, mezi sériemi 2,0 – 7,7 %. Relativní senzitivita je 99,1 %, relativní specificita 99,3 %. Koncentrace hemoglobinu 5 g/l, triacylglycerolů 11,3 mmol/l a bilirubinu 684 µmol/l interferují ≤ 15 %. Vysoká hladina HBsAg ve vzorcích může paradoxně způsobit pokles světelnosti (saturační efekt). U tohoto stanovení jsou reaktivní vzorky pacientů s koncentrací HBsAg až 3,36 g/l. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

Konfirmační test je založen na neutralizaci před testem. Analyzovaný vzorek se inkubuje s reagencií, která obsahuje lidské specifické protilátky proti HBsAg (anti-HBs). Kvůli potvrzení se stejný vzorek inkubuje v druhé testované směsi s reagencií, která neobsahuje ani HBsAg ani anti-HBs. V první směsi blokují specifické protilátky proti HBsAg všechny antigenní determinanty HBsAg přítomné ve vzorku. Antigen již nelze detekovat v následně provedeném testu na HBsAg, což vede ke snížené reaktivitě takto ošetřeného vzorku. Naopak vzorek ve druhé směsi vykazuje nezměněnou pozitivní reakci. Vzorky se v obou reakčních směsích inkubují 26 min při 37 °C. Provede se kalibrace dvěma kalibrátory jako u kvalitativního stanovení. Vzorky s koncentrací HBsAg < cutoff se považují za nereaktivní, ≥ cutoff jsou reaktivní na HBsAg. Vzorky jsou na základě konfirmačního testu považovány za pozitivní, pokud jejich reaktivita v kombinaci s první směsí (přidání protilátek anti-HBs) povede ke snížení signálu o více než 50 % ve srovnání s referenčním stanovením pomocí druhé směsi.

CLIA je další sendvičový zábleskový postup, kdy HBsAg ze vzorku se naváže během první inkubace na magnetické částice potažené myší monoklonální anti-HBs. Během další inkubace se naváže ovčí polyklonální anti-HBs značená izoluminolem. Po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je přímo úměrná hladině HBsAg a celý postup je 30 min. Dva kalibrátory upravují vzorovou kalibrační křivku, ze které se určí hodnota cutoff. Vzorky s koncentrací HBsAg < 0,9 cutoff se považují za nereaktivní, 0,9 – 1,1 cutoff jsou neurčité a ≥ 1,1 cutoff jsou reaktivní na HBsAg. Analytická citlivost je 0,018 kU/l PEI (Paul Ehrlich Institut). Preciznost v sérii 1,9 – 6,3 %, mezi sériemi 2,4 – 11,5 %. Relativní senzitivita je 99,3 %, relativní specificita 97,4 %. Ani koncentrace hemoglobinu 1 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší. Vysoká hladina HBsAg ve vzorcích může paradoxně způsobit pokles světelnosti (saturační efekt). U tohoto stanovení jsou reaktivní vzorky pacientů s koncentrací HBsAg až 4 g/l, tj. 520000 kU/l PEI.

Konfirmační test je založen na neutralizaci před testem. Analyzovaný vzorek se inkubuje s reagencií, která obsahuje lidské specifické protilátky proti HBsAg (anti-HBs). Kvůli potvrzení se stejný vzorek inkubuje v druhé testované směsi s reagencií, která neobsahuje ani HBsAg ani anti-HBs. V první směsi blokují specifické protilátky proti HBsAg všechny antigenní determinanty HBsAg přítomné ve vzorku. Antigen již nelze detekovat v následně provedeném testu na HBsAg, což vede ke snížené reaktivitě takto ošetřeného vzorku. Naopak vzorek ve druhé směsi vykazuje nezměněnou pozitivní reakci. Vzorky se v obou reakčních směsích inkubují 60 min za laboratorní teploty.  Provede se kalibrace dvěma kalibrátory jako u kvalitativního stanovení. Vzorky s koncentrací HBsAg < cutoff se považují za nereaktivní, ≥ cutoff jsou reaktivní na HBsAg. Vzorky jsou na základě konfirmačního testu považovány za pozitivní, pokud jejich reaktivita v kombinaci s první směsí (přidání protilátek anti-HBs) povede ke snížení signálu o více než 50 % ve srovnání s referenčním stanovením pomocí druhé směsi.

Jiné stanovení je založeno na dvoukrokové imunochemické reakci se sledováním luminiscence zesílené enzymem. HBsAg ze vzorku v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin reaguje s myší monoklonální anti-HBs imobilizovanou na polystyrénové kuličce; reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytím se na jiný paratop HBsAg naváže kozí polyklonální anti-HBs konjugovaná s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření 425 – 500 nm je přímo úměrná koncentraci HBsAg ve vyšetřovaném vzorku. Používá se jeden kalibrátor, umožňující určit cutoff po korekci faktorem. Výsledek < cutoff je nereaktivní, ≥ je reaktivní na HBsAg. Preciznost v sérii je 5,3 – 13,5 %, celková 7,9 – 13,5 %. Relativní senzitivita je 97,2 %, relativní specificita 100 %. Lipemické a hemolytické vzorky je třeba z analýzy vyloučit. Ani vysoké koncentrace bilirubinu 342 µmol/l neruší. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

Konfirmační test je založen na neutralizaci před testem. Analyzovaný vzorek se inkubuje s reagencií, která obsahuje polyklonální kozí protilátky proti HBsAg (anti-HBs). Kvůli potvrzení se stejný vzorek inkubuje v druhé testované směsi s reagencií, která neobsahuje ani HBsAg ani anti-HBs. Mimoto se s oběma reagenciemi testují 500x ředěné vzorky, je-li potřeba i 25000x. V první směsi blokují specifické protilátky proti HBsAg všechny antigenní determinanty HBsAg přítomné ve vzorku. Antigen již nelze detekovat v následně provedeném testu na HBsAg, což vede ke snížené reaktivitě takto ošetřeného vzorku. Naopak vzorek ve druhé směsi vykazuje nezměněnou pozitivní reakci. Vzorky se v obou reakčních směsích inkubují.  Provede se kalibrace dvěma kalibrátory jako u kvalitativního stanovení. Vzorky s koncentrací HBsAg < cutoff se považují za nereaktivní, ≥ cutoff jsou reaktivní na HBsAg. Vzorky jsou na základě konfirmačního testu považovány za pozitivní, pokud jejich reaktivita v kombinaci s první směsí (přidání protilátek anti-HBs) povede ke snížení signálu o více než 50 % ve srovnání s referenčním stanovením pomocí druhé směsi.

Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530 v jednostupňové reakci. Do zkumavky se pipetují standard nebo vzorek, paramagnetické částice potažené přes biotin-streptavidinový můstek monoklonální myší anti-HBs a monoklonální myší anti-HBs značená ALP. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je přímo úměrné množství HBsAg. Doba analýzy je 55 min. Na základě dvou kalibrátorů se vypočte cutoff. Vzorky s koncentrací HBsAg < 0,9 cutoff se považují za nereaktivní, 0,9 – 1,1 cutoff jsou neurčité a ≥ 1,1 cutoff jsou reaktivní na HBsAg. Preciznost v sérii 1,5 – 2,4 %, mezi sériemi 4,3 – 7,5 %. Relativní senzitivita je 99,2 %, relativní specificita 98,4 %. Vysoké koncentrace hemoglobinu (5 g/l), bilirubinu (513 µmol/l) a triacylglycerolů (33,9 mmol/l) neruší při analýze. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze. Vysoká hladina HBsAg ve vzorcích může paradoxně způsobit pokles světelnosti (saturační efekt). U tohoto stanovení jsou reaktivní vzorky pacientů s koncentrací HBsAg až 5 g/l.

Konfirmační test je založen na neutralizaci před testem. Analyzovaný vzorek se inkubuje s reagencií, která obsahuje lidské IgG protilátky proti HBsAg (anti-HBs). Kvůli potvrzení se stejný vzorek inkubuje v druhé testované směsi s reagencií, která neobsahuje ani HBsAg ani anti-HBs. Mimoto se s oběma reagenciemi testují 500x ředěné vzorky, je-li potřeba i 25000x. V první směsi blokují specifické protilátky proti HBsAg všechny antigenní determinanty HBsAg přítomné ve vzorku. Antigen již nelze detekovat v následně provedeném testu na HBsAg, což vede ke snížené reaktivitě takto ošetřeného vzorku. Naopak vzorek ve druhé směsi vykazuje nezměněnou pozitivní reakci. Vzorky se v obou reakčních směsích inkubují.  Provede se kalibrace dvěma kalibrátory jako u kvalitativního stanovení. Vzorky s koncentrací HBsAg < cutoff se považují za nereaktivní, ≥ cutoff jsou reaktivní na HBsAg. Vzorky jsou na základě konfirmačního testu považovány za pozitivní, pokud jejich reaktivita v kombinaci s první směsí (přidání protilátek anti-HBs) povede ke snížení signálu o více než 40 % ve srovnání s referenčním stanovením pomocí druhé směsi.

Chemiluminiscenční analýza v sendvičovém provedení, kdy se HBsAg ze vzorku váže na monoklonální myší anti-HBs, kterou jsou potaženy jamky mikrotitrační destičky a monoklonální myší anti-HBs značenou křenovou peroxidázou. Po inkubaci (29 min, 37 °C) se promytím odstraní volný materiál a přidá se luminogen (derivát luminolu + sůl peroxykyseliny) jehož oxidaci katalyzuje POD za vzniku světla. První výsledek je k dispozici za 37 min. Činidlo pro přenos elektronů (substituovaný acetanilid) zvyšuje hladinu uvolněného světla a prodlužuje jeho emisi. Signál je přímo úměrný koncentraci HBsAg ve vzorku. Pomocí kalibrátoru a korekčního faktoru se upraví vzorová kalibrační křivka a vypočte cutoff. Analytická citlivost je < 0,1 kU/l PEI. Vzorky s koncentrací HBsAg < 0,9 cutoff se považují za nereaktivní, 0,9 – 1,0 cutoff jsou neurčité a ≥ 1,0 cutoff jsou reaktivní na HBsAg. Preciznost v sérii 1,3 – 15,9 %, mezi sériemi je 3,3 – 24 %. Vysoké koncentrace hemoglobinu (5 g/l), bilirubinu (342 µmol/l) a triacylglycerolů (33,9 mmol/l) neruší při analýze. Nelze použít zakalené vzorky. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

Konfirmační test je založen na neutralizaci před testem. Analyzovaný vzorek se inkubuje s reagencií, která obsahuje lidské protilátky proti HBsAg (anti-HBs). Kvůli potvrzení se stejný vzorek inkubuje v druhé testované směsi s reagencií, která neobsahuje ani HBsAg ani anti-HBs. Mimoto se s oběma reagenciemi testují 500x ředěné vzorky, je-li potřeba i 25000x. V první směsi blokují specifické protilátky proti HBsAg všechny antigenní determinanty HBsAg přítomné ve vzorku. Antigen již nelze detekovat v následně provedeném testu na HBsAg, což vede ke snížené reaktivitě takto ošetřeného vzorku. Naopak vzorek ve druhé směsi vykazuje nezměněnou pozitivní reakci. Vzorky se v obou reakčních směsích inkubují alespoň 15 min za laboratorní teploty (maximálně 8 h). Provede se kalibrace dvěma kalibrátory jako u kvalitativního stanovení. Vzorky s koncentrací HBsAg < cutoff se považují za nereaktivní, ≥ cutoff jsou reaktivní na HBsAg. Vzorky jsou na základě konfirmačního testu považovány za pozitivní, pokud jejich reaktivita v kombinaci s první směsí (přidání protilátek anti-HBs) povede ke snížení signálu o více než 50 % ve srovnání s referenčním stanovením pomocí druhé směsi.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v sekvenčním uspořádání trvá 18 min. Vzorek (50 µl) je inkubován se dvěma biotinylovanými myšími anti-HBs a směsí monoklonální myší anti-HBs s ovčí polyklonální anti-HBs značenou ruthéniovým komplexem. Pak se přidají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem, na které se naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Po inkubaci se reakční směs nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Luminiscence je přímo úměrná hladině HBsAg ve vzorku. Provádí se dvoubodová kalibrace dovolující výpočet cutoff. Vzorky s koncentrací HBsAg < 0,9 cutoff se považují za nereaktivní, 0,9 – 1,0 cutoff jsou neurčité a ≥ 1,0 cutoff jsou reaktivní na HBsAg. Detekční limit je ≤ 0,04 kU/l PEI. Preciznost v sérii 1,2 – 8,5 %, mezi sériemi 1,1 – 23,8 %. Relativní senzitivita 99,9 %, relativní specificita je 99,9%. Hemolýza (hemoglobin 20 g/l), chylozita (triacylglyceroly 22,8 mmol/l), ikterus (bilirubin 684 µmol/l) a RF (< 6210 kIU/l) neruší. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměli odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Vzácně mohou interferovat protilátky vůči streptavidinu nebo rutheniu.

Konfirmační test je založen na neutralizaci před testem. Analyzovaný vzorek se inkubuje s reagencií, která obsahuje lidské protilátky proti HBsAg (anti-HBs). Kvůli potvrzení se stejný vzorek inkubuje v druhé testované směsi s reagencií, která neobsahuje ani HBsAg ani anti-HBs. Mimoto se s oběma reagenciemi testují 500x ředěné vzorky, je-li potřeba i 25000x. V první směsi blokují specifické protilátky proti HBsAg všechny antigenní determinanty HBsAg přítomné ve vzorku. Antigen již nelze detekovat v následně provedeném testu na HBsAg, což vede ke snížené reaktivitě takto ošetřeného vzorku. Naopak vzorek ve druhé směsi vykazuje nezměněnou pozitivní reakci. Vzorky se v obou reakčních směsích inkubují alespoň 30 – 60 min za laboratorní teploty. Provede se kalibrace dvěma kalibrátory jako u kvalitativního stanovení. Vzorky s koncentrací HBsAg < cutoff se považují za nereaktivní, ≥ cutoff jsou reaktivní na HBsAg. Vzorky jsou na základě konfirmačního testu považovány za pozitivní, pokud jejich reaktivita v kombinaci s první směsí (přidání protilátek anti-HBs) povede ke snížení signálu o více než 40 % ve srovnání s referenčním stanovením pomocí druhé směsi. Vysoká hladina HBsAg ve vzorcích může paradoxně způsobit pokles světelnosti (saturační efekt). U tohoto stanovení jsou reaktivní vzorky pacientů s koncentrací HBsAg až 1 g/l.

Mezinárodní referenční standard WHO č. 00/588.

Falešná negativita: v inkubační době viru, mutace viru pod vlivem vakcinace, defektní mutanty,cirkulující imunokomplexy HBsAg–anti-HBs, subdetekční koncentrace HBsAg (pouze pozitivita anti-HBs), současná infekce HDV (potlačení replikace HBV).

Falešná pozitivita: stanovení v čerstvě odebraném séru, heparinizovaná krev (dialyzovaní), kontaminace pozitivním sérem, přítomnost HAMA, aplikace glukokortikoidů v akutním stádiu infekce.