Pro analýzu se používá sérum, případně heparinizovaná plazma. Výjimečně se stanovuje železo i v moči. Nelze použít chelatační antikoagulanty (citronan, EDTA, šťavelan). Stažení paže při odběru krve musí být co nejkratší. Optimální je ranní odběr nalačno, protože vlivem diurnální variace může dojít k poklesu železa během dne až
o 30 %. Vzorek by měl být odstředěn co nejdříve a to bez separačního gelu, jinak již po 2 h železo v séru začne stoupat..
Stabilita železa v séru je při 20 – 25 °C 6 h – 7 dnů, při 4 – 8 °C 3 dny – 3 týdny a více než 6 měsíců při 20 °C (transferin je stabilní 1 měsíc). Hemolyzované vzorky obsahují železo z erytrocytů a výsledky jsou falešně zvýšené. Rovněž lipémie ruší stanovení. Výsledky jsou ovlivněny biorytmy, těhotenstvím, menstruačním cyklem a věkem.
Spektrofotometrie: Pro všechny fotometrické postupy je společná reakce při které jsou železité ionty redukovány v kyselém prostředí na ionty železnaté přidáním silně redukujícího činidla jako je hydrazin, kyselina askorbová, kyselina thioglykolová nebo hydroxylamin. Pak následuje reakce železnatého iontu s chromogenem a vzniká barevný komplex. Nejběžnější komplexující činidla jsou: sodná sůl 4, 7-bis(4-fenylsulfonová kyselina)-
1, 10-fenantrolinu (bathofenantrolin – maximum 534 nm), sodná sůl 3-(2-pyridyl)-5, 6-bis(4-fenylsulfonová kyselina)-1, 2, 4-triazin (ferrozin – maximum 562 nm), disodná sůl 3-(2-pyridyl)-5, 6-bis(2-furyl)-1, 2, 4-triazinu (feren – maximum 593 nm), 2, 4, 6-tri(2-pyridyl)-5-triazin (TPTZ – maximum 593 nm), 2, 6-bis(4-fenyl-
2, 2-pyridyl)-4-fenylpyridin (terosit – maximum 583 nm) nebo N-{4-[2, 4-bis(1, 1-dimetylpropyl)fenoxy]butyl}-
5-metoxy-6[(2, 3, 6,7-tetrahydro-8-1H, 5H-benzo-(ij)-chinolizin-9-yl)azo]-3-pyridin sulfonamid, dále
2, 6-bis(2-pyridyl)pyridin (terpyridin) a 4-[(3-karboxy-5-metyl-4-oxo-1-cyklohexa-2, 5-dienyliden)(2, 6-dichlorfenyl)metyl]-2-hydroxy-3-metylbenzoová kyselina (chromazurol B).
Reakce s bathofenantrolinem po redukci Fe3+ na Fe2+ hydroxylaminem poskytuje červený komplex, které se měří při 540 nm. Test je lineární v rozsahu koncentrace 7,16 – 35,8 µmol/l. Vychýlení ±0,72 %. Výtěžnost je 97 – 104 %.
Reakce s ferrozinem dává fialový komplex, který se fotometruje při 595 – 623 nm (560 nm) a postup nevyžaduje deproteinaci. Test je lineární v rozsahu koncentrace 0,9 – 179 µmol/l. Analytická citlivost je 0,2 µmol/l, funkční citlivost je 0,4 µmol/l. Vychýlení je ±1,9 %, preciznost v sérii dosáhla CV 0,98 – 1,22 %, mezi dny 1,98 – 2,48 %. Vypočtená rozšířená standardní nejistota (k = 2) byla 1,52 %.
Barevný komplex železnatých iontů s ferenem se měří při 604 nm. Metoda je lineární do 318,4 mol/l. Analytická citlivost je 0,24 µmol/l, funkční citlivost je 0,97 µmol/l. Preciznost v sérii dosáhla CV 0,62 – 0,67 %, celkem 0,9 – 1,3 %.
Železnaté ionty reagují s TPTZ za vzniku modře zbarveného komplexu, který lze bichromaticky měřit při vlnové délce 600/800 nm a postup nevyžaduje deproteinaci. Test je lineární v rozsahu koncentrace 2 – 179 µmol/l. Mez detekce metody je 0,3 µmol/l. Přesnost v sérii dosáhla CV 0,65 – 1,02 %, celkem 1,23 – 2,09 %. Rušit může vysoká koncentrace monoklonálních imunoglobulinů.
N-{4-[2, 4-bis(1, 1-dimetylpropyl)fenoxy]butyl}-5-metoxy-6[(2, 3, 6,7-tetrahydro-8-1H, 5H-benzo-(ij)-chinolizin-
9-yl)azo]-3-pyridin sulfonamid s železnatými ionty tvoří komplex, který se měří při 600 nm (nebo bichromaticky 600/700 nm). Test je lineární v rozsahu koncentrace 1,81–107,46 µmol/l. Preciznost v sérii dosáhla CV 1,9 – 5,2 %.
Metody s použitím ferrozinu nebo TPTZ dávají systematicky nižší výsledky než reakce s bathofenantrolinem, protože používají deproteinaci.
Fluorimetrie: Metoda umožňuje stanovit přímo trojmocné železo s fluorescenčním indikátorem
5-(4-metylfenylazo)-8-aminochinolinem. Mez detekce je 0,179 µmol/l, linearita metody byla do 125,3 µmol/l. Preciznost v sérii dosáhla CV 2,5 %.
Atomová absorpční spektrofotomerie (AAS): Železo se koncentruje chelatací s bathofenantrolinem a pak se extrahuje do metylizobutylketonu; extrakt se analyzuje atomovou absorpcí při 248,3 a 252 nm v plameni acetylén-vzduch (kolem 2300 °C). Vzorek je rozprašován do komůrky (účinnost 10 – 15 %) a proudí s palivem do laminárního plamene. Zde se rozpouštědlo odpařuje a dochází k atomizaci. Metoda není dost citlivá, protože signál duté katodové výbojky je slabý. Záření není dostatečně stabilní a výbojka má poměrně velký šum. Metoda byla lineární do 89,5 µmol/l. Výtěžnost metody je 90 – 102,5 %, preciznost v sérii 0,9 – 2,4 %.
Atomová emisní spektrometrie s indukčně vázanou plazmou (inductive coupled plasma AES) pracuje tak, že
z roztoku je generován zamlžovacím zařízením jemný aerosol, který je nosným plynem vnášen do indukčně vázaného plazmového zdroje, generovaného v proudu pracovního plynu, nejčastěji argonu. Prstencovitý tvar plazmového výboje s centrálním (analytickým) kanálem umožňuje účinné vnášení vzorku. Ve výboji je aerosol vysušen, odpařen, atomizován a volné atomy jsou excitovány. Záření je tvořeno čárovou emisí excitovaných atomů. Metoda se používá jen pro speciální účely, jako např. při analýze vlasů.
Radiochemická metoda je také dostupná pro měření železa v séru. Pro stanovení stabilních izotopú železa využívá radioaktivního izotopu 59Fe, který má poločas rozpadu 44,5 dne.
Coulometrie měří proud, který vzniká při přechodu elektronů mezi Fe2+ a Fe3+ po uvolnění železa z transferinu přidáním alkoholického roztoku HCl. Uvolněné železo je vystaveno rozdílným specifickým potenciálům na víceelektrodovém senzoru. Přístroj detekuje proud elektronů a vztahuje celkový elekronový tok ke koncentraci železa. Léky, které obsahují azo-skupiny mohou při coulometrii interferovat. Metoda dobře koreluje
s ferrozinovou metodou a má velmi dobrou přesnost i preciznost. Metoda je lineární v rozsahu 9 – 180 µmol/l. Výtěžnost byla 105,3 ± 9,2 % (rozhodující je kvantitativní uvolnění železa z transferinu).
Referenční metoda, která byla navržena v roce 1990 je fotometrická detekce (562 nebo 600 nm) železa po deproteinaci kyselinou trichloroctovou pomocí ferrozinu. Rozsah metody byl lineární do 53,7 µmol/l. Přitom byla dosažena výtěžnost 96 – 102 %. Preciznost dosáhla CV 0,9 – 2,5 %. Definitivní metoda v roce 2011 neexistuje.
Podle údajů College of American Pathologists má automatizovaná bathofenantrolinová metoda bez deproteinace nejnižší CV a to 3 %. Na základě biologické variability byl stanoven cíl dosáhnout přesnost 16 % při koncentraci železa 26,8 µmol/l.
Referenční materiálem je standard NIST (National Institute of Standards and Technology) pod označením
SRM 937 nebo materiál NIST SRM 1598.
Biologická variabilita intraindividuální / interindividuální (%): 25,2 / 29,7
Toleranční limit EHK: sérum a plazma 15 %.
Koncentraci železa v séru a plazmě snižují: adrenalin, akutní infarkt myokardu, bilirubin (342 µmol/l odpovídá
-2,5 µmol/l), citronan, dietní chyby, cvičení, Desferal, EDTA, fluoridy, fytáty, chronické ztráty krve, Intralipid, narušené uvolňování zásob železa, nedostatečná absorpce železa, noradrenalin, operace, perniciosní anémie, protialkoholická léčba, sezónní pokles (léto), šťavelan, těhotenství (36. týden), vysoký věk (> 80 let), aj.
Koncentraci železa v séru a plazmě zvyšují: alkohol, akutní jaterní nekrosa, hemochromatosa, hemolytická anémie, hemosiderosa, heparinát lithný (28 kU/l), hepatitida, hyperglykémie, Imferon, Intralipid (ferrozinová metoda), kyselina trichloroctová (redukce objemu po odbílkování), leukocytosa, menstruace, metabolická acidóza, orální kontraceptiva, otrava železem, sideroblastická anémie, těhotenství (12. týden), aj.
