insulin, inzulín

Stanovení se provádí v nehemolytickém séru nebo plazmě (EDTA nebo citrát sodný). Stabilita v séru i plazmě je stejná při 20 – 25 °C 4 h, při 4 – 8 °C 24 h, při -20 °C 24 týdny.

Vyšší hodnoty jsou ráno a dopoledne.

RIA v kompetitivním uspořádání, kdy inzulin ze séra a inzulin značený ¹²⁵I soutěží o vazebná místa na protilátce, kterou jsou potaženy stěny polypropylenové zkumavky. Po inkubaci 3 h při 37 °C se provede dekantace a vyklepání veškeré kapaliny za zkumavek. Následuje měření signálu gama-počítačem, který je nepřímo úměrný koncentraci inzulinu ve vzorcích. Preciznost v sérii CV < 15 %, mez detekce 3 mU/l. Při vysoké hodnotě inzulinu se vzorek ředí nulovým kalibrátorem.

IRMA sendvičového typu používá dvě myší monoklonální protilátky vůči insulinu Vzorky nebo standardy se inkubují 2 h za stálého třepání při laboratorní teplotě ve zkumavkách potažených první protilátkou společně s druhou protilátkou značenou ¹²⁵I. Po inkubaci se obsah zkumavek 2x promyje, aby se odstranila nenavázaná značená protilátka. Vázaná aktivita ¹²⁵I se poté měří na gama-počítači 1 min. Koncentrace inzulinu ve vzorcích je přímo úměrná změřené radioaktivitě a získá se interpolací ze šestibodové kalibrační křivky. Rozsah stanovení je 0,5 – 300 mU/l. Analytická citlivost je 0,5 mU/l, funkční citlivost 1,04 mU/l. Preciznost v sérii 4,3 %, mezi sériemi 3,4 %. Linearita ředění byla 87 – 119 %, zpětný výtěžek 94 – 107 %.

ELISA v sendvičovém uspořádání probíhá v mikrotitrační destičce se zakotvenou monoklonální myší protilátkou vůči inzulinu. Do jamky se přidá standard nebo vzorek a monoklonální protilátka vůči inzulinu s navázanou křenovou peroxidázou.  Po inkubaci (1 h, třepání) a promytí 3x se přidá chromogen tetrametylbenzidin a reakce probíhající ve tmě 10 min (třepání) je zastavena stop činidlem (0,46 M H₂SO₄). Měření při 450 nm nutno provést do 30 min (možno i bichromaticky proti 620 – 650 nm). Celý postup se realizuje za laboratorní teploty. Ruší silná hemolýza a projevuje se efekt nadbytku antigenu. Neruší vysoké koncentrace triacylglycerolů, bilirubinu ani heterofilní protilátky. Rozsah měření na základě pětibodové kalibrace je 0,5 – 180 mU/l (jiné soupravy na podobném principu umožňují měřit až do 500 mU/l). Preciznost v sérii je 5,1 – 7,5 %, mezi sériemi 4,2 – 9,3 %. Detekční limit je 0,5 mU/l. Linearita ředění 86 – 104 %, zpětný výtěžek 94 – 98 %. Křížová reaktivita s proinzulinem je 0,3 %.

Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) probíhá tak, že se do reakční nádobky dávkuje vzorek a poté latexové mikročástice potažené myší monoklonální protilátkou vůči inzulinu a pufr. Po inkubaci se reakční směs přenese na fritu a nenavázaný materiál se oddělí promytím. Přidá se druhá myší monoklonální protilátka vůči inzulinu značená ALP. Po inkubaci a promytí se dávkuje substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí na fluoreskující umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky. Šestibodová kalibrace je v rozsahu 1 – 300 mU/l. Vzorky s koncentrací inzulinu > 300 mU/l se ředí manuálně 5x. Preciznost v sérii je 2,6 – 4,1 %, celková preciznost metody je 4,0 – 5,3 % zpětný výtěžek 95,5 – 101 %. Senzitivita je 1 mU/l. Heterofilní protilátky v lidském séru/plazmě mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým stanovením. Erytrocytární proteázy při hemolýze mohou degradovat inzulin. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší. Křížová reaktivita s proinzulinem je 0,016 %.

Chemiluminiscenční imunoanalýza v sendvičovém uspořádání probíhá v jednom reakčním stupni. Standard nebo vzorek se smíchají s paramagnetickými mikročásticemi potaženými myší monoklonální protilátkou vůči lidskému inzulinu a s myší monoklonální protilátkou vůči lidskému inzulinu značenou akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je přímo úměrná koncentraci inzulinu a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Metoda se šestibodovou kalibrací dovoluje měřit vzorky v rozmezí koncentrací 1,0 – 300 mU/l. Vzorky s koncentrací inzulinu > 300 mU/l se ředí automaticky 2x. Preciznost v sérii 1,7 – 4,2 %, celkově 1,9 – 5,2 %. Zpětný výtěžek je 91,5 – 101,6 %. Analytická senzitivita (nulový blank) je 1,0 mU/l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší. Metoda nevykazuje křížovou reakci s proinzulinem. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 15000 mU/l.

Podobný princip zábleskové luminiscence lze použít s esterem akridinu jako značkou. První protilátka je monoklonální myší vůči inzulinu značená esterem akridinu a pak se 5 min roztok inkubuje při 37 °C. Poté se pipetuje druhá monoklonální myší protilátka vůči inzulinu, která je kovalentně vázána na paramagnetické latexové částice a opět se inkubuje 3 min při 37 °C. Po odsátí roztoku a promytí zkumavek se přidá peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk fotonásobičem při 429 nm. Vzorky s koncentrací insulinu > 300 mU/l se ředí automaticky 2,5x. Při vysokých koncentracích insulinu se projevuje efekt nadbytku antigenu. Mez detekce je 0,5 mU/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 10,6 nmol/l. Preciznost v sérii 3,2 – 4,6 %, mezi sériemi 6,3 – 7,5 %. Linearita ředění je 84,6 – 109,4 %, zpětný výtěžek 105,9 – 113,8 %. Heterofilní protilátky v lidském séru/plazmě mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým stanovením. Neruší hemolýza do 1,25 g/l hemoglobinu, triacylglyceroly do 11,3 mmol/l a bilirubin do 342 µmol/l.

CLIA je jednostupňový sendvičový zábleskový postup, kdy se na magnetické částice potažené myší monoklonální protilátkou naváže inzulin a současně se na jeho další epitop připojí druhá monoklonální myší protilátka značená izoluminolem. Imunoreakce probíhá 31,5 minut, po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je přímo úměrná hladině inzulinu. Rozsah měření na základě dvoubodové kalibrace je 0 – 500 mU/l. Analytická citlivost je 0,23 mU/l, funkční citlivost 0,61 mU/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevil do 200000 mU/l. Preciznost v sérii 1,8 – 4,3 %, mezi sériemi 3,3 – 9,9 %. Linearita ředění je 94,1 – 115 %, zpětný výtěžek 94,0 – 105,4 %. Heterofilní protilátky v lidském séru/plazmě mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým stanovením. Hemolýza, chylozita ani ikterus neruší.

Jiné stanovení používá jako značku ALP. Inzulin se v prostředí pufrovaného roztoku váže jedním epitopem na monoklonální myší protilátku imobilizovanou na polystyrenové kuličce a druhým epitopem s polyklonální ovčí protilátkou konjugovanou s alkalickou fosfatázou a třetím epitopem na monoklonální myší protilátku, která je také značená ALP. Reakce probíhá 60 minut při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se ihned rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita vzniklého záření 425 – 500 nm je přímo úměrná koncentraci inzulinu ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Stanovení se provádí v intervalu 2 – 400 mU/l. Preciznost v sérii je 5,2 – 6,4 %, celková 5,9 – 8,0; zpětný výtěžek 84 -108 %, linearita ředění 88 – 115 %. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 80000 mU/l. Fragment PTH 7-84 vykazuje křížovou reaktivitu přibližně 80 %. Hemolýza neinterferuje, ale vysoký bilirubin zapříčiňuje snížení naměřených hodnot. Rovněž ruší lipémie. Heterofilní protilátky v lidském séru/plazmě mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým stanovením.

Jiný postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530. Do zkumavky se pipetuje myší monoklonální protilátka vůči inzulinu značená ALP a standard nebo vzorek. Pak se přidají paramagnetické částice potažené myší monoklonální protilátkou vůči inzulinu. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky a přidá se chemiluminiscenční substrát. Rozsah měření při 470 nm je 0,03 – 300 mU/l (po ředění 10x 3000 mU/l). Analytická citlivost (nulový kalibrátor) 0,03 mU/l. Linearita ředění je 91 – 112 %, zpětný výtěžek 89 – 104 %. Preciznost v sérii 2,0 – 4,2 %, celková 3,1 – 5,6 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší. Heterofilní protilátky v lidském séru/plazmě mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým stanovením.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA)v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (20 µl) je inkubován s biotinylovanou monoklonální myší protilátkou vůči inzulinu a monoklonální myší protilátkou vůči inzulinu značenou ruthéniovým komplexem za vzniku sendvičové formace. Pak se přidají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem a celý komplex je vázán na pevnou fázi pomocí biotin-streptavidinové kotvy. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Luminiscence je přímo úměrná koncentraci inzulinu ve vzorku. Při hemolýze erytrocytární peptidázy degradují inzulin. Chylozita, ikterus a RF (< 18900 kIU/l) neruší. Od pacientů léčených vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměly odebírat vzorky dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Metoda je použitelná v rozsahu 0,2 – 1000 mU/l. Reprodukovatelnost v sérii CV 1,9 – 2,0 %, mezi sériemi 2,5 – 2,8 %. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 20000 mU/l. 

HPLC stanovení probíhá na reversní fázi C-18 (Hypersil BSD) za laboratorní teploty s UV detekcí při 214 nm s mobilní fází voda-acetonitril (3:2) při pH 3,2 (nastaveno pomocí H₃PO₄). Metoda je ale málo citlivá (od 247 U/l), takže v klinické biochemii prakticky nepoužitelná.

Toleranční limit EHK: 20 %.

Výsledky snižuje: hemolýza (vliv peptidáz erytrocytů), odběr do heparinu (váže inzulin), tělesné cvičení, hladovění, redukční dieta, alkohol, oxalát, serotonin. Léky: asparagináza, beta-blokátory, blokátory kalciového kanálu, Cimetidin, Corinfar, Doxazosin, Diazoxid, Etakrynová kyselina, éter, fenobarbital, fenformin, fenytoin, Furanthril, Furantral, Furosemid, Hydrochlorothiazid, chlorpromazin, chlorpropamid, kalcitonin, klofibrát, Metformin, Nifedipin, Pentamidin, propranolol, Sodanton, Streptozotocin.

Výsledky zvyšuje: obezita, kouření, podání glukagonu nebo glukózy, acetoacetát, GLP 1 (glukagon like peptid l), zvýšení proinzulinu (křížová reakce), vysoký věk, těhotenství, kontraceptiva. Léky: Albuterol, antibiotika perorální, Astmopent, Beklometason, calcium, cyklosporin, Danazol, desoxykortikosteron, Dirastan, Fentolamin, fruktóza, chinin, chinidin, Chlorpropamid, Levedopa, Lipovitan, niacin, Nutramin (C, S, U), pankreozymin, prednisolon, růstový hormon, Salbutamol, sekretin, spironolakton, Terbutalin, Tolazolamid, Tolbutamid, Ventolin.