glykohemoglobin, glykosylovaný hemoglobin

GHb, HbA1c, HbA_1c

Odběr nalačno. Maximální čas od získání do zpracování vzorku je 4 h při doporučené teplotě 20°C. Pro stanovení v krvi (hemolyzátu) je možné použít EDTA nebo heparin.
Stabilita je 2 – 3 dny při +18 až + 26 °C, 5 – 7 dní při +2 až +8 °C a 6 měsíců při -20 °C, ale dle možnosti nezamrazovat.

K dispozici je více než 30 metod ke stanovení glykovaného hemoglobinu. Metody jsou založené na separačních postupech nebo rozdělování podle náboje, nebo kombinaci obou postupů. Jedná se o iontově-výměnnou chromatografii na mikrokolonách nebo minikolonách, HPLC, afinitní chromatografii na minikolonách, elektroforézu a izoelektrickou fokusaci.

Iontově-výměnná chromatografie je založena na tom, že glykované A₁ hemoglobiny jsou při neutrálním pH méně kladně nabité než HbA₀, takže mají slabší vazbu na negativně nabitou pryskyřici a jsou eluovány dříve. Používají se dva pufry, první eluuje frakce A_1a a A_1b, druhý pak frakci A_1c. HbA₀ se neeluuje, ale stanoví jako celkový hemoglobin fotometricky. Komerčně jsou dostupné i kolony na jedno použití. Metoda je citlivá na dodržování teploty. Preciznost CV 7,2 – 32,4 %. Metodu nelze použít u nemocných s β-talasemií nebo při vrozeném přežívání HbF (falešně zvýšené výsledky).
Afinitní chromatografie dosahuje separace celkového glykovaného hemoglobinu, tj. včetně α-řetězce
a glykovaného lysinového konce, pomocí kolony s boronovou kyselinou. Glykované hemoglobiny se na ni navazují svými cis-diolovými skupinami (vzniká pětičlenný kruh). Neglykované hemoglobiny jsou eluované jako první. Následně jsou glykované hemoglobiny (mimo A_1a a A_1b) z boronátové vazby vytlačeny sorbitolem
a eluovány. Jednotlivé frakce jsou sledovány fotometricky. K dispozici jsou komerčně připravené kolony pro POCT. Výsledky jsou proti ostatním metodám trochu vyšší. Preciznost CV 3,7 – 15,2 %. Výsledky nejsou ovlivněny karbamylovaným nebo acetylovaným Hb, dalšími variantami Hb, β-talasémii a vrozeným vyšším HbF. Interferuje vysoká lipémie. Vliv teploty je menší než u iontově-výměnné chromatografie.
Afinitní chromatografie může k detekci použít také hmotnostního spektrometru s ionizací kapalné fáze elektrosprejem.
HPLC je rychlá a přesná metoda, která je považována za referenční. Hemolyzát se nastřikuje na kolonu
s katexovou pryskyřicí. Pufry se stoupající iontovou silou procházejí kolonou a jednotlivé eluované frakce se monitorují. Pro standardizaci byl navržen univerzální kalibrátor. Preciznost CV 7,1 – 11,3 %.

Elektroforetická separace HbA₁ se provádí v hemolyzátu na agaru. Využívá se schopnosti volných N-koncových skupin neglykovaného hemoglobinu reagovat s nabitými skupinami jako jsou sírany z agaru nebo pufru.
V kyselém pH neglykovaný hemoglobin putuje k anodě, většina glykovaných hemoglobinů ke katodě a frakce A_1c zůstává na aplikačním bodu. Hemoglobinové pruhy se vyhodnocují denzitometrem. Preciznost CV 3,7–11,3 % K dispozici jsou komerční soupravy pro separaci HbA₁ a HbA_1c (interferuje karbamylovaný a acetylovaný Hb) od HbA₀ (interferuje HbE₀ a HbE_1c) umožňující přímou vizualizaci jednotlivých frakcí. Interference lze omezit hemolyzačním činidlem a elektroforéza nezávisí na teplotě.
Izoelektrická fokusace: Varianty hemoglobinu se dělí na základě jejich rozdílné migrace v polyakrylamidovém gelu s gradientem pH 6 – 8. Současně lze analyzovat až 35 vzorků, které se pak hodnotí densitometrem.

Imunochemické metody detekují HbA_1c pomocí monoklonálních nebo polyklonálních protilátek rozeznávajících aminokyseliny na amino-konci β-řetězce nebo glukózový zbytek, případně obojí (ovčí polyklonální Ab). Hodnotí se poměr HbA_1c k celkovému hemoglobinu stanovenému fotometricky. Dostupné jsou metody na principu enzymové imunoanalýzy, automatizované latexové imunoaglutinační inhibice (LIAI) a automatizované turbidimetrické inhibiční imunoanalýzy (TINIA). Předpokládá se interference některých hemoglobinových variant. Preciznost CV 2,3 – 5,3 %. Některé imunoanalýzy jsou použitelné pro POCT.

Toleranční limit EHK: 20 %.

Koncentraci HbA_1c v krvi (hemolyzátu) snižují: anémie, gravidita, hemoglobin C, hemoglobin S.
Koncentraci HbA_1c v krvi (hemolyzátu) zvyšují: varianty hemoglobinu (acetylovaný Hb, karbamylovaný Hb), hemoglobin F.