Anti Hepatitis C, Hepatitis C Antibody, Hepatitis C Viral Antibody, Hepatitis C Virus Antibody, HCVAB, HCV Ab, Anti-HCV IgG

Stanovení se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans: EDTA, heparin nebo citrát). Stabilita v séru za laboratorní teploty 8 h, při 4 – 8 °C 2 d, při -20 °C 1 rok.

Všechny metody jsou kvalitativní analýzy.

ELISA probíhá tak, že se zředěný vzorek inkubuje v jamkách mikrotitračních destiček potažených vysoce purifikovanými antigeny, které obsahují sekvence z jádra a z oblastí NS3, NS4 a NS5 viru HCV. V průběhu první inkubace (60 min, 37°C nebo 30 min) se anti-HCV ze vzorku naváží na imobilizované antigeny. Po promytí 5x za účelem odstranění nenavázaného materiálu se zachycené anti-HCV inkubují s myšími monoklonálními (nebo králičími) protilátkami vůči lidskému IgG, konjugovanými s peroxidázou (30 min, 37°C). V průběhu druhé inkubace se konjugát naváže na protilátky imobilizované v prvním kroku. Po odstranění přebytečného konjugátu (promytí 5x) se navázaný enzym detekuje přidáním roztoku obsahujícího tetrametylbenzidin a peroxid vodíku. Reakce probíhá 30 min při 37 °C ve tmě. Jamky s pozitivními vzorky obsahujícími protilátky vůči HCV se zbarví do fialova. Enzymatická reakce se zastaví 0,5 M kyselinou sírovou, čímž vznikne oranžové zbarvení, které se hodnotí fotometricky při 450/620-690 nm do 15 min. Množství navázaného konjugátu, a tedy rovněž intenzita barvy v jamkách, jsou přímo úměrné koncentraci protilátek ve vzorku. Kvalitativní hodnocení: absorbance průměru negativních kontrol + 0,6 (nebo + 0,32) = cutoff. Nereaktivní výsledky na anti-HCV < cutoff, reaktivní ≥ cutoff. Preciznost v sérii je 2,9 – 7,2 %, mezi sériemi 3,9 – 10,2 %. Relativní specificita je 99,7 %. Při testování ikterických vzorků (až do 513 µmol/l bilirubinu), hemolytických vzorků (až do 18,5 g/l hemoglobinu), vzorků obsahujících revmatoidní faktory (až do 1800 kU/l) a lipemických vzorků (až do 9 mmol/l triacylglycerolů) nebyl pozorován žádný vliv na test.

Chemiluminiscenční analýza v dvojstupňovém sendvičovém uspořádání používá paramagnetické částice potažené rekombinantním HCV, na který se naváže anti-HBs ze vzorku. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá konjugát anti-IgG/anti-IgM protilátek s akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je přímo úměrná hladině anti-HCV a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Cutoff = 0,074 x kalibrátor 1 (v tripletu).Nereaktivní výsledky na anti-HCV < cutoff, reaktivní ≥ cutoff. Preciznost v sérii je 3,5 – 5,6 %, mezi sériemi 4,3 – 8,4 %. Relativní senzitivita je 96,7 %, relativní specificita 99,4 %. Koncentrace hemoglobinu 5 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neinterferují.

Podobný princip zábleskové luminiscence v sendvičovém uspořádání lze použít s esterem akridinu jako značkou. Ke vzorku se přidá hovězí albumin a kozí sérum; roztok se inkubuje 4 min při 37 °C. Pak se přidají paramagnetické latexové částice potažené rekombinantním a syntetickým HCV (vázané na částice biotin-streptavidinovým můstkem) a inkubuje se 17 min při 37 °C. Po odsátí roztoku a promytí zkumavek se opět inkubuje 4 min při 37 °C. Dále se dávkuje monoklonální myší protilátka vůči lidskému IgG značená esterem akridinu a inkubuje 17,7 min při 37 °C. Následuje odsátí roztoku a promytí zkumavek, přidá se peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk (intenzita signálu je přímo úměrná množství anti-HCV) fotonásobičem při 429 nm. K určení cut-off se provádí dvoubodová kalibrace. Vzorky s koncentrací anti-HCV < 0,8 cutoff se považují za nereaktivní, 0,8 – 1,0 cutoff jsou neurčité a ≥ 1,0 cutoff jsou reaktivní na anti-HCV. Preciznost v sérii je 2,8 – 3,1 %, mezi sériemi 4,6 – 9,0 %. Relativní senzitivita je 97,6 %, relativní specificita 99,6 %. Koncentrace hemoglobinu 5 g/l, triacylglycerolů 11,3 mmol/l a bilirubinu 684 µmol/l interferují ≤ 10 %. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

CLIA je další sendvičový zábleskový postup, kdy se anti-HCV ze vzorku naváže během inkubace na magnetické částice potažené rekombinantním HCV (jaderný a NS4 antigen) a také se vytvoří biotin-streptavidinový můstek mezi magnetickými částicemi potaženými streptavidinem a rekombinantním biotinylovaným HCV typu NS3. Po promytí se přidají myší monoklonální protilátky vůči lidskému IgG značené izoluminolem a provede se další inkubace. Po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je přímo úměrná hladině anti-HCV. Jednobodová kalibrace se provede v tripletu a určí se cutoff. Nereaktivní výsledky na anti-HCV < cutoff, reaktivní ≥ cutoff. Preciznost v sérii 1,7 – 6,2 %, mezi sériemi 5,6 – 11,3 %. Relativní senzitivita je 99,4 %, relativní specificita 97,0 %. Ani koncentrace hemoglobinu 10 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší.

Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530 v dvojstupňové reakci. Do zkumavky se pipetují paramagnetické částice potažené rekombinantním HCV (skořápkový antigen, NS3 a NS4) a standard nebo vzorek. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Během druhé inkubace se přidá kozí protilátka vůči lidskému IgG značená ALP. Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je přímo úměrné množství anti-HCV. Doba analýzy je 55 min. Cutoff = průměrná hodnota pozitivního kalibrátoru x 0,23. Vzorky s koncentrací anti-HCV < 0,9 cutoff se považují za nereaktivní, 0,9 – 1,0 cutoff jsou neurčité a ≥ 1,0 cutoff jsou reaktivní na anti-HCV. Preciznost v sérii 2,4 – 4,1 %, mezi sériemi 6,6 – 9,9 %. Relativní specificita je 99,7 %. Vysoké koncentrace hemoglobinu (5 g/l), bilirubinu (342 µmol/l) a triacylglycerolů (40,7 mmol/l) neruší při analýze.

Chemiluminiscenční analýza v dvojstupňovém sendvičovém provedení, kdy se anti-HCV ze vzorku váže na rekombinantní HCV, kterým jsou potaženy jamky mikrotitrační destičky. Po inkubaci (37 °C) se promytím odstraní volný materiál a přidá se myší monoklonální protilátka vůči lidskému IgG značená křenovou peroxidázou. Po inkubaci (37 °C) se promytím odstraní volný materiál a přidá se luminogen (derivát luminolu + sůl peroxykyseliny) jehož oxidaci katalyzuje POD za vzniku světla. Celkově trvá inkubace 45 min a první výsledek je k dispozici za 55 min. Činidlo pro přenos elektronů (substituovaný acetanilid) zvyšuje hladinu uvolněného světla a prodlužuje jeho emisi. Signál je přímo úměrný koncentraci anti-HBs ve vzorku. Cutoff se určí ze vzorové křivky po analýze kalibrátoru jako absorbance kalibrátoru x korekční faktor. Vzorky s koncentrací anti-HCV < 0,9 cutoff se považují za nereaktivní, 0,9 – 1,0 cutoff jsou neurčité a ≥ 1,0 cutoff jsou reaktivní na anti-HCV. Preciznost v sérii 1,0 – 4,2 %, mezi sériemi je 3,3 – 8,0 %. Relativní senzitivita je 100 %, relativní specificita 99,7 %. Vysoké koncentrace hemoglobinu (5 g/l), bilirubinu (342 µmol/l) a triacylglycerolů (33,9 mmol/l) neruší při analýze. Nelze použít zakalené vzorky.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (50 µl) je inkubován s biotinylovaným HCV a HCV značeným ruthéniovým komplexem. Pak se přidají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem, na které se naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Po inkubaci se reakční směs nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Luminiscence je přímo úměrná hladině anti-HCV ve vzorku. Provádí se dvoubodová kalibrace a na jejím základě se vypočítá cutoff. Vzorky s koncentrací anti-HCV < 0,9 cutoff se považují za nereaktivní, 0,9 – 1,0 cutoff jsou neurčité a ≥ 1,0 cutoff jsou reaktivní na anti-HCV. Preciznost v sérii 0,7 – 16,3 %, mezi sériemi 1,6 – 20,4 %. Relativní senzitivita 99,6 %, relativní specificita je 99,4 %. Hemolýza (hemoglobin 10 g/l), chylozita (triacylglyceroly 22,6 mmol/l), ikterus (bilirubin 1129 µmol/l) a RF (< 1200 kIU/l) neruší. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměli odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Vzácně mohou interferovat protilátky vůči streptavidinu nebo rutheniu.

Rekombinantní imunoblot (RIBA) je kvalitativní enzymová imunoanalýza na proužcích. Detekce anti-HCV je založena na tradiční technice western blot a dot (tečkový) blot, kdy jsou specifické imunogeny (např. polyproteiny) zakódované v HCV genomu imobilizovány na membráně. Vizualizace anti-HCV reaktivity se provádí konjugátem kozí protilátky vůči lidskému IgG s POD. S konjugátem pak reaguje enzymový substrát (4-chlor-1-naftol) a reakce se vyhodnocuje vizuálně. Každý proužek obsahuje 4 pásy s HCV zakódovanými antigeny/peptidy, rekombinantní lidský suproxiddismutázový (SOD) a dva kontrolní IgG pásy (pro nízkou a vysokou reaktivitu, tj. 1+, resp.3+). Výsledek je negativní na anti-HCV, je-li vybarven pouze pás SOD, anebo žádný pás. Výsledek je neurčitý, je-li vybarven jen jeden pás HCV (mimo SOD), nebo více pásů HCV včetně SOD. Výsledek je pozitivní, jsou-li vybarveny alespoň dva pásy HCV a pás SOD je negativní.

Falešná negativita: u imunodeficience (deficit protilátek, infekce HIV, u dialyzovaných, u příjemců transplantátu) – nezbytné je PCR; odběr v inkubační době před serokonverzí na protilátku.

Falešná pozitivita: 0,2 % těhotných žen, při zvýšení koncentrace IgG (paraproteinemie, produkce protilátek), po vakcinaci proti chřipce, vysoký revmatoidní faktor, při opakovaném zmrazení a rozmrazení.